1、目的：
　　檢測(cè)丁香活性組分(The active fraction from clove，AFC)對(duì)人結(jié)腸癌HCT116、SW620、HCT8、HT29、LOVO細(xì)胞增殖的抑制作用，篩選出抑制作用最明顯的HCT116細(xì)胞株;探討丁香活性組分誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞產(chǎn)生自噬與凋亡，并通過聯(lián)合自噬特異性抑制劑巴弗洛霉素A1(Baflomycin A1)、3-甲基腺嘌呤（3-MA）闡明其誘導(dǎo)的凋亡與自噬之間的相互關(guān)系;研究丁香活性組分對(duì)人

2、結(jié)腸癌細(xì)胞PI3K/Akt/m-TOR信號(hào)通路的影響，揭示丁香活性組分誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞自噬與凋亡的分子機(jī)制。
　　方法：
　　1、細(xì)胞培養(yǎng)：HCT116、SW620、HCT8、HT29、LOVO細(xì)胞株復(fù)蘇后，分別用McCoy's5A、RPMI1640、RPMI1640、DMEM高糖、F12培養(yǎng)基+10％胎牛血清+1％青霉素鏈霉素液，于37℃、5％CO2條件下孵箱中培養(yǎng)。
　　2、細(xì)胞活力檢測(cè)：①AFC(25、50、10

3、0、200、400μg/ml)處理各腫瘤細(xì)胞48h，CCK8法檢測(cè)各腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞增殖能力變化。②AFC(25、50、100μg/ml)處理HCT116細(xì)胞24、48、72h，CCK8法檢測(cè)AFC對(duì)HCT116細(xì)胞細(xì)胞增殖能力的時(shí)間濃度依賴性影響。
　　3、細(xì)胞凋亡檢測(cè)：AFC(25、50、100μg/ml)作用于HCT116細(xì)胞48h后，采用Hoechst33258熒光染色、流式細(xì)胞儀AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法檢測(cè)A

4、FC對(duì)HCT116細(xì)胞凋亡的影響;采用Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋Caspase-3、Caspase-9、PARP的表達(dá)。
　　4、細(xì)胞自噬檢測(cè)：①GFP-LC3轉(zhuǎn)染：Ad-mCherry-GFP-LC3B重組腺病毒轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞24h，加入AFC100μg/ml繼續(xù)培養(yǎng)48h，4％多聚甲醛固定，熒光顯微鏡下拍照并計(jì)數(shù)自噬斑點(diǎn)的數(shù)目來檢測(cè)自噬水平的強(qiáng)弱。②透射電子顯微鏡觀察：胰酶收集細(xì)胞，以2.5％的戊二醛溶液、1

5、％四氧化鋨溶液固定后，采用梯度乙醇溶液脫水，環(huán)氧樹脂812包埋細(xì)胞，制成超薄切片。醋酸雙氧鈾和醋酸鉛染色后在透射電鏡觀察自噬體和自噬溶酶體的形成。
　　結(jié)果：
　　1、CCK8結(jié)果顯示，AFC對(duì)HCT116、SW620、HCT8、HT29、LOVO的半數(shù)抑制濃度分別是113.5±7.83μg/ml、174.9±9.52μg/ml、211.7±7.29μg/ml、232.3±15.42μg/ml、280.9±12.61tg/m

6、l，抑制作用最明顯的是人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116。AFC（25-100μg/ml）作用HCT116細(xì)胞24h，CCK8結(jié)果顯示并未對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生很明顯的抑制效果;作用HCT116細(xì)胞48h，25、50、100μg/ml AFC分別能抑制細(xì)胞活力至84.06％±9.15％、80.05％±6.05％、68.20％±4.12％;作用HCT116細(xì)胞72h，25、50、100μg/ml AFC分別能抑制細(xì)胞活力至81.03％±7.2％、74.33％±

7、7.51％、61.43％±4.32％;50、100μg/ml AFC組在48、72h與對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.01）。
　　2、Hoechst33258染色后在熒光顯微鏡下觀察到對(duì)照組細(xì)胞成彌散均勻的淡藍(lán)色弱熒光，細(xì)胞形態(tài)趨于一致。25、50、100μg/ml AFC處理細(xì)胞后，均能觀察到典型的細(xì)胞凋亡特征，如核染色質(zhì)濃縮、核碎裂、凋亡小體的出現(xiàn)等，且各組凋亡形態(tài)學(xué)改變的程度與AFC作用的濃度呈正相關(guān)。Anne

8、xinⅤ-FITC/PI雙染法檢測(cè)顯示，25、50、100μg/ml的AFC誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞率分別為8.35％±0.61％、17.68％±1.19％、26.95％±1.75％，50、100μg/ml組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，（P值均＜0.001）;Western blot結(jié)果顯示，Caspase-9、Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP均被AFC以濃度依賴方式激活。50、100μg/ml AFC組Cl

9、eaved Caspase-3/Procaspase-3、Cleaved PARP/PARP、Caspase-9/Actin與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.01）。
　　3、①GFP-LC3轉(zhuǎn)染后熒光顯微鏡下觀察到結(jié)果：對(duì)照組細(xì)胞mCherry-GFP-LC3B以彌散的黃色熒光形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，100μg/ml AFC組細(xì)胞出現(xiàn)明顯自噬斑點(diǎn)，mCherry-GFP-LC3B聚集在自噬體膜上，以黃色斑點(diǎn)和紅色斑點(diǎn)的形式

10、表現(xiàn)出來。②100μg/ml AFC作用于HCT116細(xì)胞48h后，透射電鏡觀察到大量的自噬體和自噬溶酶體，而對(duì)照組則無明顯變化。③Western blot結(jié)果顯示，AFC(25、50、100μg/ml)作用12、24、48h后，自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1相對(duì)表達(dá)量均呈濃度依賴性的逐漸增高。50μg/ml、100μg/mlAFC組在12、24、48h時(shí)，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.0

11、5）;Beclin-1/Actin與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.01）。
　　4、CCK8法結(jié)果顯示，作用于HCT116細(xì)胞48h后，BA組、3-MA組、AFC組、AFC+3-MA組、AFC+BA組分別抑制細(xì)胞增值率為91.5％±7.09％、89.7％±9.01％、74.3％±5.13％、40.5％±2.51％、54.2％±4.04％。BA組、3-MA組與對(duì)照組比較，無顯著差異;AFC組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

12、P＜0.001);AFC+3-MA組、AFC+BA組與AFC組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.001）。AnnexinⅤ/PI雙染法檢測(cè)顯示，Control組、BA組、3-MA組、AFC組、AFC+3-MA組、AFC+BA組凋亡率分別為6.36％±0.31％、6.65％±0.40％、7.21％±0.69％、27.64％±1.74％、45.02％±1.85％、40.8％±1.79％。BA組、3-MA組與對(duì)照組比較，無顯著差異;AFC組

13、與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，（P＜0.001）;AFC+3-MA組、AFC+BA組與AFC組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.01）。Western blot結(jié)果顯示，與Control組比較，自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ在3-MA組、AFC+3-MA組中相對(duì)表達(dá)量明顯減少，在AFC組、BA組、AFC+BA組中相對(duì)表達(dá)量明顯增加;自噬相關(guān)蛋白Beclin-1在AFC組中相對(duì)表達(dá)量明顯增加，在BA組、3-MA組、AFC+3-MA、A

14、FC+BA組中相對(duì)表達(dá)量明顯下降。Western Blot結(jié)果顯示，與Control組比較，凋亡相關(guān)蛋白Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP在AFC組、AFC+3-MA、AFC+BA組中相對(duì)表達(dá)量顯著上升，而在BA組、3-MA組中無明顯變化。分析顯示Cleaved Caspase-3/Procaspase-3、Cleaved PARP/PARP，BA組、3-MA組與Control組比較，無顯著差異;AFC組與Co

15、ntrol組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，（P＜0.01）;AFC+3-MA組、AFC+BA組與AFC組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.001）。
　　5、Western blot結(jié)果顯示，與Control組比較，p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量呈濃度依賴性的遞減，而PI3K、Akt、m-TOR在各組間無明顯變化。50、100μg/ml AFC組p-Akt/Akt、p-mTOR/m-TOR表達(dá)量與Control組

16、比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.01）。Western blot結(jié)果顯示，LY294002(10μM)、AFC(100μg/ml)、AFC+LY294002作用HCT116細(xì)胞48h后，與Control組比較，p-Akt、p-mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量呈依次降低，而Akt、m-TOR在各組間無明顯變化。AFC組與Control組比較，p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.001）;AFC+LY2940

17、02組與AFC組比較，p-Akt/Akt差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)，p-mTOR/mTOR差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、AFC對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116、SW620、HCT8、HT29、LOVO的增殖均有一定抑制作用，但作用明顯的是HCT116細(xì)胞，呈現(xiàn)一定的時(shí)間、濃度依賴性。
　　2、AFC濃度相關(guān)性的誘導(dǎo)人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞發(fā)生凋亡，凋亡發(fā)生的途徑與線粒體依賴性的Caspase

18、激活有關(guān)。
　　3、AFC誘導(dǎo)人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞發(fā)生自噬，誘導(dǎo)自噬的作用呈現(xiàn)時(shí)間、濃度依賴性。
　　4、AFC聯(lián)合自噬抑制劑BA、3-MA能減弱AFC誘導(dǎo)的HCT116細(xì)胞自噬，而增強(qiáng)其誘導(dǎo)的凋亡的發(fā)生，說明AFC誘導(dǎo)的HCT116細(xì)胞自噬對(duì)細(xì)胞起到保護(hù)性的作用，提高細(xì)胞對(duì)AFC的抵抗能力。
　　5、AFC單獨(dú)用藥或聯(lián)合LY294002用藥，均證實(shí)AFC能濃度相關(guān)性的抑制PI3K/Akt/m-TOR通路，這與AF