1、背景與目的:
　　在人體組織器官缺損修復(fù)中，生物材料的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。這類(lèi)材料用于修復(fù)或替代病損組織器官并恢復(fù)其功能，且對(duì)人體無(wú)明顯不良影響。生物相容性是材料在臨床應(yīng)用的重要制約因素，David Williams對(duì)人體植入材料的生物相容性定義如下：既能達(dá)到預(yù)期的既定目標(biāo)，又不引起任何預(yù)期之外的局部或全身反應(yīng)的性能。在整形外科領(lǐng)域，生物材料往往用做填充材料，主要分為天然來(lái)源生物材料和人工生物材料兩種。人工生物材料又包括金屬材料，無(wú)機(jī)

2、非金屬材料以及高分子材料。
　　羥基磷灰石是六方磷灰石系列的一種，它具有優(yōu)良的生物相容性，無(wú)毒、無(wú)刺激性、無(wú)排斥反應(yīng)、不老化、不致敏、不致癌。同時(shí)羥基磷灰石有很好的骨傳導(dǎo)性，HA于骨之間結(jié)合牢固，與骨組織能達(dá)到較理想的生物結(jié)合。但是它脆性較高，難以雕刻成形。
　　本課題組結(jié)合兩種材料的優(yōu)點(diǎn)，避開(kāi)兩種材料的缺點(diǎn)揚(yáng)長(zhǎng)避短，前期成功制備羥基磷灰石涂層硅橡膠，并對(duì)其進(jìn)行理化性能檢測(cè)和初步的細(xì)胞相容性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)羥基磷灰石涂層硅橡膠材料

3、理化性能良好，并可以改善硅橡膠表面細(xì)胞相容性較差的缺陷。本課題將在前期研究的基礎(chǔ)上對(duì)制備好的羥基磷灰石涂層硅橡膠材料的細(xì)胞相容性進(jìn)行進(jìn)一步的評(píng)價(jià)，并采用體內(nèi)植入實(shí)驗(yàn)研究材料的生物相容性，同時(shí)對(duì)材料的生物安全性進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)一步研究在材料一細(xì)胞界面中細(xì)胞和材料之間相容性的具體影響因素，探索在羥基磷灰石涂層硅橡膠表面細(xì)胞相容性較普通硅橡膠提高的可能分子機(jī)制。
　　方法:
　　本課題實(shí)驗(yàn)分四部分
　　第一部分:HA/SR的生物

4、相容性檢測(cè)和生物安全性評(píng)價(jià)
　　1、材料的生物相容性檢測(cè)
　　將羥基磷灰石涂層硅橡膠以及普通硅橡膠表面培養(yǎng)的細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞骨架染色，CCK8檢測(cè)，掃描電鏡觀察以及材料表面細(xì)胞粘附相關(guān)分子包括vinculin、zyxin、talin等的分子檢測(cè)進(jìn)一步研究材料表面的細(xì)胞相容性，通過(guò)體內(nèi)植入實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究材料的生物相容性。
　　2、材料的生物安全性評(píng)價(jià)
　　通過(guò)材料溶血率測(cè)定，試驗(yàn)動(dòng)物體重、肝腎功能、臟器表面觀察，植入實(shí)

5、驗(yàn)及HE染色、Masson染色、免疫組化染色(CD4、CD68、TNF-a、a-SMA、elastin)，刺激實(shí)驗(yàn)，過(guò)敏試驗(yàn)和致熱源實(shí)驗(yàn)研究材料毒理學(xué)性能和生物安全性。
　　第二部分:OPN在材料表面的吸附情況研究:
　　1、大鼠創(chuàng)面滲出液處理的材料表面蛋白吸附:
　　通過(guò)收集大鼠創(chuàng)面滲出液浸泡SR、HA-1/SR、HA-2/SR三種材料后進(jìn)行材料表面普通光鏡觀察、掃描電鏡觀察，和測(cè)定材料表面水接觸角分析大鼠創(chuàng)面滲出液

6、浸泡處理后材料的性能變化，WB驗(yàn)證材料表面吸附的OPN蛋白情況。
　　2、材料表面粘附細(xì)胞OPN的表達(dá)和分泌情況
　　SR、HA-1/SR、HA-2/SR三種材料表面體外培養(yǎng)人真皮成纖維細(xì)胞，收集培養(yǎng)上清，提取細(xì)胞總蛋白，WB實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證材料表面粘附細(xì)胞OPN的分泌以及表達(dá)情況。
　　第三部分:OPN在HA/SR表面細(xì)胞粘附中的重要橋梁作用研究
　　1、OPN對(duì)材料表面培養(yǎng)細(xì)胞粘附的影響
　　分別在SR、HA-

7、1/SR、HA-2/SR三種材料表面培養(yǎng)人真皮成纖維細(xì)胞，同時(shí)分別在每組材料培養(yǎng)的細(xì)胞體系中加入外源性重組人OPN蛋白和OPN抗體，觀察每組細(xì)胞的粘附情況。
　　2、OPN在細(xì)胞遷移中的作用
　　利用外源性O(shè)PN蛋白作為細(xì)胞趨化劑，采用Trans well細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證OPN在細(xì)胞遷移中的作用。結(jié)合OPN對(duì)材料表面培養(yǎng)的細(xì)胞粘附情況共同揭示OPN蛋白在羥基磷灰石涂層硅橡膠材料表面的細(xì)胞粘附和遷移的重要作用。
　　第四

8、部分:HA/SR細(xì)胞相容性提高的分子機(jī)制研究
　　1、通過(guò)RNA干擾技術(shù)降低MMP9的表達(dá)，了解OPN和MMP9的關(guān)系。采用質(zhì)譜分析和生物信息學(xué)手段探索OPN和MMP9是通過(guò)哪種具體分子機(jī)制調(diào)控材料表面細(xì)胞骨架重排，介導(dǎo)羥基磷灰石涂層硅橡膠生物相容性的改變。
　　2、在SR、HA-1/SR、HA-2/SR三種材料表面體外培養(yǎng)人真皮成纖維細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE分離，經(jīng)過(guò)凝膠成像系統(tǒng)采集圖片，分析并切取差異點(diǎn)

9、蛋白酶解后行質(zhì)譜分析，在EMBL，NCBI等數(shù)據(jù)庫(kù)分析質(zhì)譜結(jié)果，分析可能的分子機(jī)制并采用WB回復(fù)驗(yàn)證。
　　結(jié)果:
　　1、HA/SR的生物相容檢測(cè)
　　(1)將羥基磷灰石涂層硅橡膠以及普通硅橡膠表面培養(yǎng)的細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞骨架染色，CCK8檢測(cè)，掃描電鏡觀察，明確HA/SR表面具有較好的細(xì)胞相容性可以顯著提高材料表面的細(xì)胞粘附和增殖。
　　(2)通過(guò)對(duì)材料表面細(xì)胞粘附相關(guān)分子包括vinculin、zyxin、tali

10、n等的分子檢測(cè)進(jìn)一步研究材料表面的細(xì)胞相容性，揭示羥基磷灰石涂層硅橡膠確實(shí)可以提高材料表面細(xì)胞粘附分子的表達(dá)，即提高SR表面的細(xì)胞粘附能力。
　　(3)通過(guò)將材料在大鼠體內(nèi)植入7天，30天，90天，180天后取出，對(duì)材料周?chē)M織HE染色發(fā)現(xiàn)組織生長(zhǎng)狀態(tài)良好，實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了HA/SR材料的生物相容性。
　　2、HA/SR的毒理學(xué)性能檢測(cè)及生物安全性評(píng)價(jià)
　　通過(guò)材料溶血率測(cè)定，試驗(yàn)動(dòng)物體重、肝腎功能、臟器表面觀察，植入

11、實(shí)驗(yàn)及材料周?chē)M織HE染色、Masson染色、免疫組化染色(CD4、CD68、TNF-a、a-SMA、elastin)，刺激實(shí)驗(yàn)，過(guò)敏試驗(yàn)和致熱源實(shí)驗(yàn)研究材料毒理學(xué)性能和生物安全性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明HA/SR安全無(wú)毒副作用，符合國(guó)家生物材料安全性的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。
　　3、OPN蛋白在HA/SA表面的吸附情況
　　(1)通過(guò)對(duì)大鼠創(chuàng)面滲出液浸泡的材料表面外表觀察、掃描電鏡分析以及水接觸角分析，我們發(fā)現(xiàn)大鼠創(chuàng)面滲出液浸泡的材料表面水接觸

12、角下降了，這可能與材料表面吸附有某種親水性蛋白質(zhì)有關(guān)。
　　(2)通過(guò)對(duì)HA/SR以及SR表面細(xì)胞的粘附蛋白質(zhì)層進(jìn)行WB驗(yàn)證，證明材料表面確實(shí)有OPN蛋白的吸附，同時(shí)，OPN蛋白在HA/SR表面的吸附量比SR表面吸附量更大，這可能與HA/SR較SR表面細(xì)胞相容性更佳有關(guān)。
　　(3)通過(guò)對(duì)材料表面粘附細(xì)胞外分泌的OPN蛋白以及細(xì)胞內(nèi)的OPN蛋白進(jìn)行半定量分析，證明在HA/SR表面粘附細(xì)胞分泌的OPN蛋白以及細(xì)胞內(nèi)OPN蛋白的

13、表達(dá)都較SR表面細(xì)胞高，進(jìn)一步說(shuō)明OPN在材料表面的吸附可能與HA/SR材料的細(xì)胞相容性提高有重要關(guān)系。
　　4、OPN在HA/SR表面細(xì)胞粘附中的橋梁蛋白作用
　　(1)通過(guò)外源性O(shè)PN的加入和OPN的抗體阻斷實(shí)驗(yàn)可以看出:在HA/SR以及SR表面，外源性O(shè)PN的加入可以使得材料表面細(xì)胞的粘附增強(qiáng)，而當(dāng)OPN抗體的加入使的材料表面OPN的結(jié)合減弱時(shí)，材料表面細(xì)胞粘附同時(shí)減弱，這一結(jié)果表明在HA/SR表面細(xì)胞相容性的提高和O

14、PN存在著重要的正向相關(guān)性。
　　(2)通過(guò)Trans Well實(shí)驗(yàn)，OPN作為外源性蛋白加入細(xì)胞趨化小室外室可以顯著提高成纖維細(xì)胞的穿膜能力揭示了OPN可能在材料/細(xì)胞界面提高細(xì)胞的遷移能力相關(guān)。通過(guò)對(duì)材料的表面蛋白質(zhì)層的吸附分析以及采用外源性O(shè)PN蛋白的加入和OPN抗體的阻斷，采用WB，Transwell等實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段明確OPN在材料/細(xì)胞界面的重要作用，揭示OPN蛋白在羥基磷灰石涂層硅橡膠材料表面的細(xì)胞粘附和遷移中發(fā)揮著重要

15、作用。
　　5、HA/SR細(xì)胞相容性提高的分子機(jī)制
　　(1)HA/SR材料表面MMP9的活性較SR表面顯著增加，這表明隨著羥基磷灰石在SR表面涂層，MMP9的活性增強(qiáng)了，這一點(diǎn)和HA/SR表面OPN的分泌趨勢(shì)一致，這也表明MMP9可能和OPN存在某種正向相關(guān)性。
　　(2)MMP9干擾后材料表面細(xì)胞的粘附數(shù)量減少，細(xì)胞形態(tài)也呈現(xiàn)比較凌亂的狀態(tài)，細(xì)胞骨架成皺縮，固著狀態(tài)，但是這一形態(tài)的改變和粘附數(shù)量的減少可以為OPN所

16、逆轉(zhuǎn)，表明MMP9是OPN的下游分子參與細(xì)胞粘附，提高材料表面的相容性。
　　(3)通過(guò)質(zhì)譜結(jié)果分析并通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)和EMBL數(shù)據(jù)庫(kù)，找出主要差異點(diǎn)蛋白通過(guò)文獻(xiàn)檢索和分析我們提出可能是EF1β介導(dǎo)的γ-actin導(dǎo)致細(xì)胞骨架重排，從而影響材料表面細(xì)胞相容性，同時(shí)這一猜想被EF1β干擾致材料表面細(xì)胞粘附減弱這一實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象所證實(shí)。
　　結(jié)論:
　　1、HA/SR具有良好的生物相容性。
　　2、HA/SR安全無(wú)毒，符