1、隨著工業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展，有毒重金屬污染越來越受到關(guān)注。重金屬能在生物體內(nèi)累積，最終通過食物鏈危害人類的健康。傳統(tǒng)的重金屬污染土壤修復(fù)技術(shù)通常都耗費(fèi)較高而且對(duì)環(huán)境有較大傷害。因此，急需一種行之有效且經(jīng)濟(jì)的去除環(huán)境中重金屬的方法。原位植物修復(fù)技術(shù)因其成本低、環(huán)境友好且行之有效而受到國(guó)內(nèi)外研究者的關(guān)注，被認(rèn)為是一種極具前景的污染環(huán)境修復(fù)方法。然而，重金屬的植物修復(fù)的實(shí)際應(yīng)用還有不少問題亟待解決，譬如重金屬植物毒性、修復(fù)周期長(zhǎng)且污染物提取量有限等。

2、現(xiàn)有的植物修復(fù)強(qiáng)化措施（譬如轉(zhuǎn)基因和螯合劑等）雖然有效但費(fèi)用昂貴且對(duì)環(huán)境有潛在風(fēng)險(xiǎn)。因此，尋求一條經(jīng)濟(jì)且有效的微生物強(qiáng)化途徑提高植物修復(fù)效率將意義重大。
　　 本文自鎘超累積植物龍葵中分離得到多株內(nèi)生菌，通過多種性能指標(biāo)篩選菌株Serratia nematodiphila LRE07作為模式菌株，用以研究利用植物-內(nèi)生菌共生系統(tǒng)強(qiáng)化植物修復(fù)的可行性。將菌株S.nematodiphila LRE07接種到龍葵種子后，通過營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)

3、方法深入研究了系列鎘處理濃度下龍葵植株生長(zhǎng)、生理參數(shù)、光合成色素和鎘吸收累積特性，探討了內(nèi)生菌接種對(duì)植物抗壓性能的影響。在此基礎(chǔ)上，研究了鎘脅迫下植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的攝取、脂質(zhì)過氧化水平和活性氧代謝的變化，以揭示內(nèi)生菌在降低重金屬植物毒性和促進(jìn)植物生長(zhǎng)中的可能作用機(jī)制。另外，還研究了菌株S.nematodiphila LRE07的穩(wěn)定性和其在非宿主植物體內(nèi)的作用效果。主要的研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　 ①龍葵內(nèi)生菌的分離與篩選

4、　　 用于內(nèi)生菌分離的龍葵植株采自株洲冶煉廠(27°52′N，113°05′ E)污水排水渠堤，自該植物不同組織體內(nèi)分離得到97株內(nèi)生菌，其中大部分為細(xì)菌。通過最小抑制濃度測(cè)定發(fā)現(xiàn)所有內(nèi)生菌對(duì)重金屬均有不同程度抗性，這表明超累積植物是篩選重金屬抗性菌株的天然資源。自龍葵根部得到一株產(chǎn)深紅色色素的細(xì)菌，命名為L(zhǎng)RE07。通過16S rDNA分析鑒定該菌株為沙雷氏菌株（Serratia nematodiphila）。S.nematodip

5、hila LRE07表現(xiàn)出對(duì)多種重金屬均有較高抗性，尤其是對(duì)銅、鎘和鉻。同時(shí)，對(duì)該菌株進(jìn)行植物促生相關(guān)的生物學(xué)性能測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)S.nematodiphila LRE07具有產(chǎn)吲哚乙酸、鐵載體和增溶礦質(zhì)磷酸鹽的能力。上述性能表明該菌株具有重金屬抗性和植物促生潛力，因此確定S.nematodiphila LRE07為下一步實(shí)驗(yàn)菌株。
　　 ②內(nèi)生菌接種對(duì)龍葵植株生長(zhǎng)和鎘吸收的影響
　　 通過營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)方法，研究龍葵植株對(duì)鎘

6、脅迫的響應(yīng)和內(nèi)生菌接種對(duì)植株抗壓性能的影響。接種21天和70天后取植物樣測(cè)定菌株接種效率。結(jié)果表明內(nèi)生菌S.nematodiphila LRE07成功接種入植株體內(nèi)，自宿主植物根部和地上部分組織內(nèi)重分離得到的菌落數(shù)表現(xiàn)出依賴時(shí)間增長(zhǎng)的趨勢(shì)，鎘脅迫未對(duì)內(nèi)生菌生長(zhǎng)造成抑制作用。上述結(jié)果表明S.nematodiphila LRE07能與宿主植物和諧共生。鎘濃度的遞增對(duì)龍葵生長(zhǎng)造成了不同程度抑制作用，表現(xiàn)在植株的分蘗數(shù)、鮮重和株高。隨著重金屬接

7、觸時(shí)間延長(zhǎng)，0μM和10μM濃度下接種植物和未接種植物的分蘗數(shù)比率均有增加，但高濃度（50和100μM）下分蘗數(shù)比率很快達(dá)到恒定值甚至在實(shí)驗(yàn)后期減少。營(yíng)養(yǎng)液中重金屬濃度越高，植物的分蘗數(shù)比率越低。在同一鎘脅迫濃度下，接種內(nèi)生菌的植株分蘗數(shù)比率要高于未接種植株(P＜0.05，MANOVAs)，即接種植株的葉片數(shù)更多。內(nèi)生菌接種對(duì)植株生長(zhǎng)的有利影響在植株鮮重、株高和根重上也有體現(xiàn)。內(nèi)生菌的積極意義在低鎘脅迫(10μM)下尤為顯著，在該濃度下

8、，接種植物生長(zhǎng)未見顯著抑制，其生物量比未接種植株提高了58％。
　　 內(nèi)生菌的接入對(duì)宿主植物植物光合作用色素含量有積極影響。隨著鎘濃度的升高和接觸時(shí)間延長(zhǎng)，植物光和色素含量呈現(xiàn)線性減少趨勢(shì)。但是，在鎘脅迫條件下（除了100μM，第三天樣品外），接種內(nèi)生菌的植物葉片中類胡蘿卜素、葉綠素a和葉綠素b的含量均要高于未接菌的植株(P＜0.05，MANOVAs)。另外，在同一鎘濃度下，由鎘脅迫導(dǎo)致的植物光合作用色素含量的減少量要明顯小于未

9、接菌植株，即接入內(nèi)生菌的植株光合作用色素受鎘影響較小。
　　 隨著營(yíng)養(yǎng)液中重金屬鎘濃度的增加，植物累積了大量鎘在其根部和地上部分。然而，內(nèi)生菌接種與否對(duì)單位質(zhì)量植物組織累積鎘沒有顯著差異（除了莖部，鎘10和100μM），即單位干重植株組織吸收的鎘量相近。相比于未接菌對(duì)照植株，雖然內(nèi)生菌株的植入沒有極大改變重金屬鎘在其宿主植物組織中的濃度，但是提高了植物的生物量，由此產(chǎn)生的結(jié)果就是接菌的植物單株重金屬鎘提取量有極大提高（在10μM

10、 Cd條件下，增長(zhǎng)量達(dá)到72±5％），這反映出內(nèi)生菌的植入提高了植物提取效率。
　　 ③內(nèi)生菌在降低重金屬植物毒性和促進(jìn)植物生長(zhǎng)中的可能作用機(jī)制
　　 Cd導(dǎo)致了植物組織中Fe含量的提高，然而Mn和Zn的含量均有所減少，除了根部Zn含量沒有顯著變化。這些結(jié)果表明Cd改變了其他重金屬離子在植物體內(nèi)的傳輸。接種內(nèi)生菌S.nematodiphila LRE07減緩了這種由鎘誘導(dǎo)了金屬含量變化。在10、50、100μM鎘濃度條件

11、下，接種內(nèi)生菌株的植株各組織（根、莖、葉）中Mn的含量都要高于未接種植株。相比于未接菌對(duì)照，接菌植物在其葉部和頸部吸收了更多的Fe和Zn。
　　 不論接菌與否，植物組織中丙二醛含量隨著鎘濃度和接觸時(shí)間均呈現(xiàn)線性提高。但是，從結(jié)果可以看出，接菌植株的丙二醛含量要低于未接菌對(duì)照，雖然兩者之間沒有統(tǒng)計(jì)性差別。另外，丙二醛含量隨接觸時(shí)間的增加量在接菌植株中也要小得多。
　　 為了反映鎘脅迫條件下植物體內(nèi)抗氧化代謝酶的活性，我們選

12、取了SOD，GPX，CAT和APX作為解毒活性氧毒害作用酶系的代表，測(cè)定了這些酶在鎘脅迫狀況下的變化。鎘誘導(dǎo)使得SOD含量顯著增加，在10μM和50μM鎘濃度條件下接菌植株SOD的活性要明顯要于未接種植物。CAT活性在兩種處理之間沒有顯著區(qū)別。10μM和50μM鎘條件下，接菌植物葉片中GPX和APX活性要明顯高于未接菌植物。鎘濃度的提高導(dǎo)致了兩種處理的植物的根部GPX含量都呈線性增加，但是在50μM和100μM鎘濃度條件下，接菌植株根部

13、GPX含量要明顯高于未接菌植株。上述結(jié)果表明接種內(nèi)生菌株S.nematodiphila LRE07提高了宿主植物的抗氧化能力、降低了鎘脅迫導(dǎo)致的活性氧傷害。
　　 ④內(nèi)生菌的穩(wěn)定性和在非宿主植物體內(nèi)的作用
　　 通過比較不同處理的兩代植物體內(nèi)內(nèi)生菌菌落和植物生長(zhǎng)狀況，探討內(nèi)生菌在宿主植物體內(nèi)的穩(wěn)定性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩代植物體內(nèi)的目的菌株的菌落數(shù)沒有顯著性差異。PCR-DGGE圖譜分析顯示兩代植株體內(nèi)細(xì)菌DNA呈現(xiàn)較高一致性。

14、同時(shí)傳代內(nèi)生菌保存對(duì)植物生長(zhǎng)的積極影響，兩代植株各項(xiàng)生長(zhǎng)指數(shù)均沒有顯著性差異。這表明內(nèi)生菌能能植物體內(nèi)穩(wěn)定存活，并在植物子代中保持原有活性。
　　 將S.nematodiphila LRE07接種入豌豆并將植株置于鎘脅迫條件下以探討內(nèi)生菌對(duì)非宿主植物的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)重金屬脅迫抑制植物種子萌發(fā)，內(nèi)生菌接種沒能緩解重金屬對(duì)非宿主植物豌豆發(fā)芽率的脅迫影響。接種S.nematodiphila LRE07能提高植物生物量，對(duì)提高植物對(duì)抗重