1、研究背景：
　　外泌體（exosomes）是真核細(xì)胞釋放的一種由磷脂雙層分子層構(gòu)成的類膜囊結(jié)構(gòu)，它能將分子信號水平地從一個細(xì)胞傳遞至另一個細(xì)胞，影響受體細(xì)胞的功能和行為。Exosomes所包含的成分和攜帶的信息主要決定于其源細(xì)胞的特性。腫瘤細(xì)胞來源的exosomes具備完整的mRNAs、 microRNAs、蛋白質(zhì)，攜載腫瘤細(xì)胞信息。
　　有研究表明，腫瘤可與周圍環(huán)境“cross-talk”影響周圍正常間質(zhì)細(xì)胞，使間質(zhì)細(xì)胞表

2、型發(fā)生改變并釋放金屬蛋白酶及趨化因子，以降低細(xì)胞黏附力、破壞基底膜和促血管生成，有利于腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。在腫瘤細(xì)胞改造正常細(xì)胞的過程中，是否存在腫瘤細(xì)胞 exosomes通訊方式。
　　本課題以小鼠黑素瘤B16-F10細(xì)胞和其同源的C57小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF細(xì)胞）為材料，研究B16-F10細(xì)胞的exosomes對MEF細(xì)胞的侵襲遷移性的影響，驗證腫瘤細(xì)胞向正常細(xì)胞傳遞侵襲性的exosomes通訊方式，從exosomes細(xì)胞

3、間通訊的角度，詮釋腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移性的現(xiàn)象,為尋求控制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的方法提供一種新的思路。目的
　　1.確定B16-F10細(xì)胞exosomes的制備方法及其結(jié)構(gòu)特征。
　　2.分析B16-F10細(xì)胞exosomes對MEF的侵襲性的影響，驗證腫瘤細(xì)胞向正常細(xì)胞傳遞侵襲性的exosomes通訊方式。
　　方法：
　　1.采用100000×g超速離心方法從B16-F10細(xì)胞培養(yǎng)上清液中分離提取 exosomes，納米

4、顆粒跟蹤分析法分析尺度分布，戊二醛固定、環(huán)氧樹脂包埋、枸櫞酸鉛染色后透射電鏡觀察 exosomes超微結(jié)構(gòu)， Western-blot分析TSG101、TYRP2的表達(dá)情況。
　　2.從13.5天C57小鼠胚胎分離純化小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）。將B16-F10細(xì)胞的exosomes與MEF細(xì)胞共培養(yǎng)，實時無標(biāo)記動態(tài)細(xì)胞分析技術(shù)（RTCA）記錄不同濃度exosomes與MEF共培養(yǎng)72小時MEF細(xì)胞侵襲力和遷移力的動態(tài)變化。收集

5、共培養(yǎng)48h的MEF細(xì)胞， qPCR檢測細(xì)胞的 MMP-2、MMP-9、E-cadherin mRNA表達(dá)， Western-blot檢測 MMP-2、MMP-9、E-cadherin蛋白表達(dá)水平。采用CFSE熒光染料示蹤 exosomes，共聚焦熒光顯微鏡觀察 exosomes與MEF細(xì)胞的融合過程。
　　結(jié)果：
　　1.100000×g超速離心法從B16-F10細(xì)胞分離出一種具有直徑約主要分布在90~430 nm，平均粒

6、徑為169.7±4.62nm的脂質(zhì)雙分子膜構(gòu)成的囊泡狀結(jié)構(gòu)，并表達(dá)exosomes特征蛋白TSG101、黑素瘤特征蛋白TYRP2。
　　2. B16-F10細(xì)胞exosomes與MEF細(xì)胞共培養(yǎng)72h，exosomes濃度0.6g/L組MEF細(xì)胞侵襲力最強(qiáng)，exosomes濃度1.2g/L組次之，0.3g/L組與對照組無明顯差異（p>0.05）不具濃度依賴性。0.6g/L exosomes組12h、24h時未見明顯差異（p>0.0

7、5），36h時，共培養(yǎng)組MEF細(xì)胞指數(shù)（CI）高于對照組（p<0.05），當(dāng)培養(yǎng)至48h時，共培養(yǎng)組CI值明顯高于對照組（p<0.01）。共培養(yǎng)組MEF細(xì)胞MMP-2、MMP-9蛋白及mRNA表達(dá)高于對照組，E-cadherin蛋白及RNA表達(dá)低于對照組。MEF細(xì)胞的遷移力未見明顯變化（p>0.05）。CFSE-exosomes與MEF細(xì)胞共培養(yǎng)6h后，在MEF細(xì)胞間可CFSE-exosomes的綠色熒光，偶見具有綠色熒光的MEF細(xì)胞。

8、共培養(yǎng)12h后，可見部分MEF細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)綠色熒光。共培養(yǎng)18h后，接近一半的MEF細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)綠色熒光，共培養(yǎng)至48h時，幾乎所有的MEF細(xì)胞內(nèi)均可見綠色熒光。
　　結(jié)論：
　　1.采用100000×g超速離心的方法可制備主要分布在90~430 nm，平均粒徑為169.7±4.62nm，具有脂質(zhì)雙分子膜并表達(dá)特征蛋白TSG101、TYRP2蛋白的exosomes。
　　2.來自于 B16-F10細(xì)胞的 exosomes進(jìn)