1、背景和目的：
　　 越來越多的流行病學調查表明，慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)是威脅全球公共健康的主要疾病之一。本課題組前期研究結果顯示，鄭州市20歲以上成年人CKD標化患病率為11.51％。從病理進展的角度來講，無論其病因為高血壓、糖尿病或者慢性腎炎，CKD進展至終末期腎臟病時，病理類型主要表現(xiàn)為腎小球硬化和腎小管間質纖維化。目前很多研究關于人類腎臟疾病或者動物實驗中發(fā)現(xiàn)，腎素-血管緊張素系

2、統(tǒng)（Renin-angiotensin system，RAS）在腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展中起著至關重要的作用。腎素-血管緊張素系統(tǒng)的過度興奮不僅僅表現(xiàn)為通過血液動力學的改變促使血壓上升，加速殘腎單位的腎小球硬化，而且血管緊張素Ⅱ（Angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ）還通過一些非血液動力學的作用直接或間接地參與了腎小球硬化的發(fā)生與發(fā)展。RAS抑制劑——血管緊張素受體拮抗劑(Angiotensin receptor antagonist，AR

3、B)的臨床應用成為抑制腎小球硬化、延緩CKD進展的有效方法之一。本課題組Fogo等前期進行的動物體內實驗研究提出大劑量RAS抑制劑可通過降低纖溶酶原激活物抑制物-1(Plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）的表達從而逆轉腎小球硬化。而PAI-1除了具有抑制細胞外基質分解促進合成的作用，同時PAI-1也在足細胞中表達，可以直接調節(jié)足細胞分化和細胞骨架重構。足細胞是腎小球濾過屏障的重要組成部分，足細胞

4、損傷必將導致蛋白尿的出現(xiàn)并促進腎小球硬化。腎小球硬化與細胞外基質的增多積聚密不可分，Ⅳ型膠原作為細胞外基質和基底膜的主要成分，其合成和分泌增多是導致腎小球硬化的主要參與因素之一。目前足細胞損傷及修復是腎臟病學研究的熱點，最新研究顯示壁層上皮細胞具有轉分化為足細胞的潛能，進而修復損傷的足細胞。然而，長期應用ARB是否可以更多地保護足細胞、逆轉腎小球硬化、改善長期生存率，目前尚缺乏與此相關的報道。因此，本研究擬采用5/6腎切除大鼠模型，觀察

5、長期應用ARB（氯沙坦）對CKD大鼠生存率的改善及其對足細胞的保護作用，并通過體外原代培養(yǎng)足細胞，觀察血管緊張素Ⅱ誘導足細胞凋亡情況和氯沙坦對受損足細胞分泌Ⅳ型膠原的影響，深入探討了ARB對足細胞損傷保護作用及可能機制，為臨床長期應用ARB延緩CKD進展、改善CKD生存率提供可能的實驗依據(jù)。
　　 本研究共分兩個部分:
　　 體內實驗:觀察長期應用氯沙坦改善5/6腎切除CKD大鼠生存率及其對足細胞損傷的修復作用
　

6、　 建立5/6腎切除CKD大鼠模型并于8周末通過開放腎活檢證實腎小球硬化，觀察長期應用氯沙坦對大鼠30周生存率的改善作用和腎組織PAI-1的表達，并探討氯沙坦對足細胞的保護作用及其機制。
　　 體外實驗:探討氯沙坦對血管緊張素Ⅱ刺激足細胞損傷的保護作用及其機制
　　 體外原代培養(yǎng)WT和PAI-1-/-小鼠足細胞，分別給予血管緊張素Ⅱ刺激，觀察足細胞凋亡情況，進一步證實血管緊張素Ⅱ促進PAI-1分泌誘導足細胞凋亡;在此基

7、礎上給予氯沙坦干預，觀察血管緊張素Ⅱ對足細胞分泌Ⅳ型膠原的情況及氯沙坦對受損足細胞分泌Ⅳ型膠原的影響，深入探討了氯沙坦對足細胞的保護作用及機制。
　　 第一部分:體內實驗長期應用氯沙坦改善5/6腎切除CKD大鼠生存率及對足細胞損傷的修復作用
　　 一、材料與方法：
　　 雄性SD大鼠50只，250～300克。建立5/6腎切除CKD大鼠模型并于8周末通過開放腎活檢PAS染色證實腎小球硬化，經歷兩次手術后存活大鼠41

8、只，按照腎小球硬化指數(shù)(SclerosisIndex，SI)、血壓、24小時尿蛋白定量匹配后分為兩組:對照組(CONT,n=21)，ARB組(ARB，氯沙坦200mg/L溶于飲用水中，n=20)，兩組SI、血壓、24小時尿蛋白定量平均值相當。于0、8、16、24及30周分別測量體重、血壓、24小時尿蛋白定量和血肌酐;觀察大鼠存活情況至30周，于瀕死前或30周末處死大鼠留取腎組織，行PAS染色觀察腎小球硬化程度的變化，行Westernbl

9、ot觀察腎組織PAI-1的表達，行免疫組織化學方法WT-1染色（足細胞標記）和免疫熒光雙染法Claudin1（壁層上皮細胞標記）和Synaptopodin（足細胞標記）染色檢測腎小球內足細胞損害/修復及壁層上皮細胞-足細胞轉化。用Kaplan-Meier法進行單因素生存分析（用log-rank法進行顯著性檢驗），并繪制生存曲線。將單因素分析對生存率有統(tǒng)計學意義的因素再納入多因素Cox回歸分析模型進行分析，運用ROC曲線評價硬化指數(shù)在生存

10、評判中的價值，并找出適宜的臨界點值。所得結果選取α=0.05作為差異具有統(tǒng)計學意義的檢驗水準。
　　 二、結果：
　　 1.兩組大鼠8周時血壓、24小時尿蛋白定量均升高，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，16、24周時ARB組血壓、24小時尿蛋白定量均低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。24、30周ARB組血肌酐均低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 2.ARB組大鼠30周生存率明顯高于

11、對照組，差異有統(tǒng)計學意義（中位生存時間27.1周vs19.7周，ARBvsCONT，P=0.0056）。單因素生存分析結果顯示腎活檢時硬化指數(shù)(P=0.0057)、蛋白尿(P=0.0113)、是否給予ARB干預(P=0.0128)是影響生存率的重要因素。根據(jù)多因素Cox回歸分析模型得到，在其他因子水平固定的情況下，對照組的死亡風險是ARB組的3.5倍（P=0.0019），腎活檢即給予干預時硬化指數(shù)每增加一個單位，死亡風險增加2.9倍(P

12、=O.0006)。腎活檢硬化指數(shù)的ROC曲線下面積(AUC)為0.65，最佳Cut-off值取1.1，即對于慢性腎臟病大鼠，應于早期進行干預以延長生存時間。根據(jù)Cut-off值對大鼠分成亞組，ARB對硬化指數(shù)不同的大鼠生存率均有改善（SI＜1.1大鼠，中位生存時問＞30周vs20.6周，ARBvsCONT，P=0.0284;SI＞1.1大鼠，中位生存時間22周vs17.3周，ARBvsCONT，P=0.0153)。
　　 3.A

13、RB組大鼠終點時間點平均硬化指數(shù)和每周硬化指數(shù)進展率均低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 4.ARB組大鼠終點時間點PAI-1表達低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 5.腎活檢時各組腎小球內足細胞較正常大鼠減少，壁層上皮細胞數(shù)目較正常大鼠明顯增多，終點時間時ARB組腎小球內足細胞數(shù)目及壁層上皮細胞的表達均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);免疫熒光雙染顯示ARB組存在更多壁層

14、上皮細胞標記Claudin-1和足細胞標記Synaptopodin雙陽性情況，提示ARB可能促進壁層上皮細胞-足細胞轉分化修復足細胞損傷。
　　 第二部分:體外實驗氯沙坦對血管緊張素Ⅱ刺激足細胞損傷的保護作用及機制探討
　　 一、材料與方法：
　　 原代培養(yǎng)野生型和PAI-1-/-小鼠足細胞，行WT-1、nephrin和Synaptopodin染色鑒定。將野生型和PAI-1-/-小鼠足細胞分別分為兩組:對照組、A

15、ngⅡ(10-7M，24h)，檢測細胞上清中PAI-1的活性及PAI-1缺失對AngⅡ所致足細胞凋亡的保護作用。為觀察ARB對AngⅡ刺激足細胞分泌Ⅳ型膠原的影響及PAI-1在其中發(fā)揮的作用，我們將野生型和PAI-1-/-小鼠足細胞分別分為三組:對照組、AngⅡ(10-7M，48h)組和AngⅡ(10-7M，48h)+ARB(10-5M，72h)組，ELISA法檢測細胞上清中IV型膠原表達量。
　　 二、結果：
　　 1

16、.足細胞的鑒定。免疫熒光染色鑒定3個表達分化成熟的足細胞標志性抗原WT-1、nephrin和synaptopodin，證實該細胞為純化的足細胞。
　　 2.AngⅡ刺激野生型小鼠足細胞分泌PAI-1增多，AngⅡ使野生型足細胞凋亡增加90.91％，給予AngⅡ刺激后，野生型小鼠足細胞抑制凋亡蛋白Bcl-xL表達較對照組顯著下降（P＜0.05）;而AngⅡ對PAl-1-/-小鼠足細胞的刺激分泌PAI-1和凋亡影響不大，對Bcl-x

17、L表達量也并無影響（P＞0.05）。
　　 3.ELISA結果顯示，與對照組相比，AngⅡ可明顯誘導野生型小鼠足細胞Ⅳ型膠原分泌增多(P＜0.05)，給予ARB后可幾乎完全阻斷AngⅡ的這種誘導作用;而與野生型足細胞相比，PAI-1缺失可減少AngⅡ誘導足細胞Ⅳ型膠原的分泌(P＜0.05)。
　　 結論：
　　 1.氯沙坦可改善5/6腎切除大鼠30周生存率，腎小球硬化程度較低的大鼠生存時間較長。
　　 2

18、.氯沙坦可降低5/6腎切除大鼠血壓、蛋白尿，改善腎功能，延緩腎小球硬化進展。
　　 3.氯沙坦對腎臟的保護作用可能是通過降低PAI-1表達介導的。
　　 4.壁層上皮細胞-足細胞轉分化可能參與了損傷足細胞的修復，氯沙坦可能促進該轉分化過程延緩CKD進展。
　　 5.PAI-1缺失可改善血管緊張素Ⅱ所致足細胞凋亡。
　　 6.氯沙坦可阻斷血管緊張素Ⅱ誘導足細胞的Ⅳ型膠原分泌，PAI-1缺失可減少AngⅡ誘導