1、革蘭氏陰性(G-)菌感染引起的膿毒癥(sepsis)是重癥監(jiān)護病房(intensivecare unit，ICU)常見的致死原因。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是G-菌細胞壁的主要成分，也是其致病的關(guān)鍵成分。由于LPS的識別和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是宿主對G-菌發(fā)生防御反應(yīng)的關(guān)鍵，所以對LPS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究一直是相關(guān)領(lǐng)域的熱點。研究發(fā)現(xiàn)，血漿中的LPS首先和LPS結(jié)合蛋白(LPS binding protein，LBP)結(jié)合，

2、LBP募集并將LPS轉(zhuǎn)運到CD14(cluster of differentiation-14)。CD14能結(jié)合并聚集LPS信號，但由于它缺乏跨膜區(qū)和胞漿內(nèi)段，不能將LPS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)到細胞內(nèi)，因此人們推測存在一個或多個跨膜受體轉(zhuǎn)導(dǎo)LPS信號。隨后的研究發(fā)現(xiàn)TLR4是跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)LPS信號的主要受體。目前已知TLR4介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)包括髓樣細胞分化因子88(myeloid differentiation factor88，MyD88)依賴性和非依

3、賴性途徑。MyD88依賴性途徑主要介導(dǎo)NF-κB活化、細胞因子的產(chǎn)生，而MyD88非依賴性途徑主要負責(zé)LPS誘導(dǎo)的IFN誘導(dǎo)性蛋白10(IFN-inducible protein10)、糖皮質(zhì)激素終止反應(yīng)基因16(glucocorticoid attenuated respinse gene16，GARG-16)、IFN調(diào)節(jié)基因1(IFN-regulated genel，IRG-1)表達和樹突狀細胞成熟。
　　 雖然TLR4是L

4、PS跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要受體，但在體外轉(zhuǎn)染了TLR4的人胚腎細胞(human embryonic kidney-derived293cell line，HEK293)和Ba/F3細胞(amouse IL-3-dependent pro-B cell line)不能轉(zhuǎn)導(dǎo)LPS信號。隨后的研究發(fā)現(xiàn)TLR4介導(dǎo)的LPS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)需要一種稱為髓樣分化蛋白-2(myeloid differentiation-2，MD-2)的輔助。MD-2蛋白由160

5、個氨基酸組成，相對分子量為25-30kD，其N端有一段由16個氨基酸殘基組成的信號肽，使MD-2具有分泌性。MD-2廣泛分布于造血系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)，B細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞、血管內(nèi)皮細胞等都有MD-2表達。
　　 研究發(fā)現(xiàn)，MD-2合成后大部分在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/高爾基體與TLR4結(jié)合，然后以TLR4/MD-2復(fù)合物的形式在細胞表面表達，參與LPS信號的識別和轉(zhuǎn)導(dǎo)。目前認為，TLR4并不與LPS直接結(jié)合，而是通過MD-2的協(xié)助

6、將LPS的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)到細胞內(nèi)。MD-2如何協(xié)助TLR4傳遞LPS信號，MD-2與TLR4相互作用的結(jié)構(gòu)域是什么一直是相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點。早期研究認為影響MD-2與TLR4結(jié)合的主要結(jié)構(gòu)是Cys95和Cys105兩個半胱氨酸殘基，但近年來研究發(fā)現(xiàn)MD-2的Cys37-Cys51袢環(huán)和Cys95-Cys105袢環(huán)及周圍一些位點都有可能參與TLR4的結(jié)合。同樣，對TLR4與MD-2作用的結(jié)構(gòu)域也尚不明確，最近有研究認為TLR4N端的氨基酸可能是

7、結(jié)合MD-2的區(qū)域。由此可見，我們對細胞識別LPS信號的機制的認識還十分有限，所獲得的結(jié)果尚存在爭議，這可能與不同實驗室用不同的實驗方法進行研究有關(guān)。另外，由于這些研究采用的都是體外實驗，所以無法獲得MD-2與TLR4相互作用的直接證據(jù)。
　　 基于以上認識，本課題采用熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)(Fluorescence resonanceenergy transfer，F(xiàn)RET)在活體細胞研究TLR4與MD-2之間的關(guān)系，以期得到確

8、切的結(jié)果。
　　 FRET被認為是研究活體細胞內(nèi)蛋白-蛋白相互作用最好的方法之一。相比于傳統(tǒng)研究蛋白質(zhì)相互作用的方法，例如免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation，Co-IP)和親和層析(affinity chromatography)，F(xiàn)RET不需要破碎細胞，能保留蛋白質(zhì)在完整細胞中所具有的正常生理條件，并且能提供相互作用蛋白質(zhì)空間分布的信息；與免疫化學(xué)共定位相比，F(xiàn)RET能直接說明特定蛋白質(zhì)之間是否發(fā)生了相互

9、作用。由于這些特點，F(xiàn)RET成為目前研究活體細胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用最可靠的方法之一。
　　 FRET是指當兩熒光分子距離足夠近時(通常在10nm以內(nèi))，激發(fā)供體分子受體分子發(fā)射出熒光。根據(jù)這一原理，我們可以用FRET來研究蛋白質(zhì)分子之間的相互作用。一對理想的FRET熒光基團，要求供體的發(fā)射光譜和受體的吸收光譜有明顯的重疊，同時供體的發(fā)射光譜和受體的發(fā)射光譜要完全分開。青色熒光蛋白(cyan flurescent protein，C

10、FP)和黃色熒光蛋白(yellow flurescent protein，YFP)是目前常用的一對熒光基團，完全滿足以上要求，并且其R0為4.9nm，可以在7.8nm范圍內(nèi)進行FRET測定。
　　 目前，顯微鏡測定FRET的方法基本可以分為兩大類：一類是基于熒光強度的方法，另一類是基于熒光動態(tài)衰減的方法。我們采用的是基于熒光強度的三通道FRET計算，這主要適用于活細胞的FRET研究。理論上，準確進行三通道FRET定量測量必須要進

11、行一定的校正，主要包括三個方面：FRET濾光片檢測到的非FRET成分，熒光串色(用CFP濾光片檢測到受體熒光分子信號或YFP濾光片檢測到供體熒光分子信號)及供受體表達濃度的影響。
　　 針對這三個方面，我們采用以下方法進行校正。在濾光片的選擇上，我們采用了德國Carl Zeiss公司的濾光片組：CFP、YFP、CFP-YFP-FRET，它們能有效削減光譜串色，提高FRET信號的信號噪聲比。由于熒光串色的量與熒光蛋白的表達濃度成正

12、比，而蛋白表達濃度又與最佳曝光時間成反比。為了消除熒光串色的影響，我們將CFP和YFP分別表達，計算出供體/受體校正因子(Donor/Acceptor Correction Factor)。我們采集并計算了100個不同最佳曝光時間細胞的供體校正因子，運用SPSS13.0軟件將得到的供體校正因子和曝光時間做曲線估計分析(Curver Estimation)，得出供體校正因子和曝光時間的最佳計算方程為：供體校正因子=19.6766+0.02

13、5X曝光時間-0.00003X曝光時間2+0.000000012X曝光時間，相關(guān)系數(shù)為0.822。我們同時計算了數(shù)十個不同最佳曝光時間下的受體校正因子，結(jié)果均為0，說明我們選擇的濾光片能有效削減YFP和FRET通道的光譜串色。為了比較不同細胞間的FRET值，消除供受體表達濃度對FRET計算的影響，我們采用了Xia的方法進行FRET標準化計算。Xia的方法將去除背景和串色得出的FRET灰度值除以供體和受體信號的平方根，能有效減少供體和受體

14、表達濃度對FRET值的影響。
　　 在此基礎(chǔ)上，我們將CFP和YFP以15個中性氨基酸相連的融合蛋白CY-15P作為檢測目標，將共同表達的CFP和YFP蛋白作為系統(tǒng)的陰性對照，各取二十個細胞，用AxioVisionFRET4.6軟件進行數(shù)據(jù)采集和Xia的方法進行FRET值計算，結(jié)果獲得了較高的FRET值，并且與陰性對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義，證明FRET系統(tǒng)建立成功。
　　 為了研究MD-2與TLR4的相互作用結(jié)構(gòu)域，我們將

15、MD-2Cys95-Cys105袢環(huán)周圍5個可能與TLR4作用的氨基酸Arg90、Lys91、Asp99、Asp100和Tyr102分別突變?yōu)锳la。將5個MD-2的突變體在HEK293細胞分別表達或分別與TLR4共表達，結(jié)果表明分別突變這5個氨基酸不影響MD-2和TLR4的表達。同時我們選取CFP-MD-2R90A與YFP-TLR4共表達，研究突變對其結(jié)合TLR4的影響，F(xiàn)RET結(jié)果顯示MD-2R90A突變并不影響和TLR4的結(jié)合。<

16、br>　　 同時為了研究TLR4與MD-2作用的結(jié)構(gòu)域，本課題構(gòu)建了TLR4N端18個氨基酸(Glu24-Met41)缺失的突變體，在HEK293細胞上比較MD-2與野生型TLR4及MD-2與TLR4突變體間的FRET值。結(jié)果表明N端Glu24-Met41缺失的TLR4結(jié)合MD-2的能力明顯下降，Glu24-Met41很可能是TLR4結(jié)合MD-2的區(qū)域。為了進一步研究N端Glu24-Met41缺失對TLR4聚合的影響，在Hela細胞，

17、我們將野生型TLR4和TLR4突變體各自與CFP和YFP融合表達，檢測LPS刺激下TLR4間FRET值的變化。實驗表明野生型TLR4在LPS刺激下，在1min到2min有一過性的FRET增強，隨后這種結(jié)合迅速減弱，在5min左右消失；而N端Glu24-Met41缺失的TLR4突變體則沒有觀察到FRET現(xiàn)象。這說明TLR4N端的Glu24-Met41突變還可能影響TLR4的聚合，但這種作用是通過影響與MD-2的結(jié)合導(dǎo)致，還是直接由于這段區(qū)

18、域參與TLR4聚合，還需要進一步的實驗研究。
　　 綜上所述，我們利用Carl Zeiss活細胞影像系統(tǒng)成功建立了FRET技術(shù)平臺，并利用該系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)TLR4N端的Glu24-Met41很可能是結(jié)合MD-2的區(qū)域。同時通過檢測LPS刺激下FRET值的變化，發(fā)現(xiàn)TLR4N端的Glu24-Met41還參與TLR4的聚合作用。另外我們發(fā)現(xiàn)MD-2的Arg90、Lys91、Asp99、Asp100和Tyr102五個位點突變不影響MD-2及