1、目的：研究豐加霉素對(duì)A549細(xì)胞增殖及凋亡的影響，初步評(píng)價(jià)低濃度豐加霉素的抗腫瘤作用并探討其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機(jī)制。
　　方法：
　　1.為初步了解豐加霉素的抗腫瘤作用及其濃度依賴性，將A549細(xì)胞分為5組，在含有10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分別用0μM、0.05μM、0.1μM、0.5μM、1μM的豐加霉素處理細(xì)胞，然后置于37℃，O2濃度為1%，CO2濃度為5%的三氣培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24h后，用CCK-8法檢測(cè)

2、細(xì)胞的存活情況。
　　2.為了研究豐加霉素對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響及時(shí)間依賴性。將A549細(xì)胞分為空白對(duì)照組和豐加霉素處理組，空白對(duì)照組用無(wú)毒的DMSO（豐加霉素的溶劑）處理，豐加霉素組用0.5μM豐加霉素處理后，置于37℃，O2濃度為1%，CO2濃度為5%的三氣培養(yǎng)箱中，用CCK-8法檢測(cè)培養(yǎng)0h、3h、6h、12h、24h、36h后的細(xì)胞增殖情況，作出生長(zhǎng)曲線。
　　3.為明確研究豐加霉素對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響，將A5

3、49細(xì)胞分為常氧組、常氧+豐加霉素組、低氧組、低氧+豐加霉素組，所有低氧條件下的細(xì)胞均置于37℃，O2濃度為1%，CO2濃度為5%的三氣培養(yǎng)箱中，24h后用Annexin V-APC/7-AAD細(xì)胞凋亡試劑盒染色后，流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)A549細(xì)胞凋亡情況。
　　4.為進(jìn)一步探索豐加霉素促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機(jī)制，將A549細(xì)胞分為常氧組、常氧+豐加霉素組、低氧組、低氧+豐加霉素組，培養(yǎng)24h后，用Western-blot檢

4、測(cè)IRE1α、XBP1s以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)性凋亡因子（CHOP、JNK、CASPASE-4）的蛋白表達(dá)情況，同時(shí)，用Real-time PCR檢測(cè)出IRE1α、XBP1s以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)性凋亡因子（CHOP、JNK、CASPASE-4）的mRNA水平。
　　結(jié)果:
　　1.用0μM、0.05μM、0.1μM、0.5μM、1μM的豐加霉素處理后A549細(xì)胞的OD值逐漸減小，分別為1.384±0.014、0.884±0.042

5、、0.802±0.053、0.763±0.021、0.774±0.040，提示隨著豐加霉素濃度升高，A549細(xì)胞的存活數(shù)量逐漸減少。
　　2.在空白對(duì)照組中，A549細(xì)胞在0h、3h、6h、12h、24h、36h的OD值分別為0.220±0.025、0.255±0.012、0.299±0.019、0.373±0.017、0.666±0.057、1.050±0.016，提示在空白對(duì)照組中A549細(xì)胞近似指數(shù)遞增。然而，用0.5μM的

6、豐加霉素干預(yù)后，A549的細(xì)胞OD值分別為：0.218±0.016、0.268±0.016、0.285±0.009、0.316±0.010、0.316±0.010、0.114±0.015，結(jié)果顯示豐加霉素處理組中A549細(xì)胞增殖緩慢，并且在24h后出現(xiàn)負(fù)增長(zhǎng)趨勢(shì)。
　　3.流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，常氧組中A549細(xì)胞的早期凋亡率與晚期凋亡率分別為1.58%±0.07%、1.67%±0.07%；低氧組中A549細(xì)胞的早期凋亡率與晚

7、期凋亡率分別為1.62%±0.12%、1.70%±0.09%；常氧+豐加霉素組中的A549細(xì)胞凋亡率增加，早期凋亡率與晚期凋亡率分別為1.85%±0.10%、3.86%±1.15%；在低氧+豐加霉素組中細(xì)胞凋亡率最高，早期凋亡率與晚期凋亡率分別是2.82%± 0.27%、4.77%±0.20%。
　　4.結(jié)果顯示，常氧組中A549細(xì)胞IRE1α的RNA相對(duì)量為1.00±0.01，常氧+豐加霉素組中IRE1α的RNA相對(duì)量

8、為0.97±0.13，在低氧組和低氧+豐加霉素組IRE1α的RNA相對(duì)量升高，分別為1.89±0.06、1.93±0.04。另外，在常氧組中XBP1s的RNA相對(duì)量為1.00±0.05，常氧+豐加霉素組中XBP1s的RNA相對(duì)量減少為0.40±0.02，低氧組中XBP1s的RNA相對(duì)量相對(duì)于常氧組升高為1.59±0.06，然而在低氧+豐加霉素組中XBP1s的RNA水平顯著降低為0.45±0.04。
　　在常氧組中，CHOP、JNK

9、、Caspase-4的相對(duì)蛋白量分別為：0.27±0.01、0.52±0.03、0.32±0.03,；在低氧組中CHOP、JNK、Caspase-4的相對(duì)蛋白量分別為0.31±0.02、0.86±0.03、0.33±0.03；在常氧+豐加霉素組中，其相對(duì)蛋白量分別為0.42±0.02、0.94±0.03、0.41±0.03,；在低氧+豐加霉素組中，相對(duì)蛋白量分別為0.54±0.02、1.03±0.08、0.51±0.02。另外，CHOP

10、、JNK、Caspase-4的RNA相對(duì)量表現(xiàn)出與蛋白一致的趨勢(shì)，在常氧組中，CHOP、JNK、Caspase-4的RNA相對(duì)量分別為1.00±0.08、1.00±0.03、1.00±0.14；低氧組中分別為1.06±0.08、1.01±0.10、1.13±0.11；常氧+豐加霉素組中分別為1.44±0.09、2.37±0.12、2.02±0.05；低氧+豐加霉素組中分別為2.08±0.05、3.47±0.31、3.25±0.95。