1、腫瘤的早期檢測(cè)對(duì)挽救生命至關(guān)重要，能夠明顯提高患者的生存率。發(fā)展簡(jiǎn)便易行、特異性高、敏感性強(qiáng)的腫瘤檢測(cè)與診斷技術(shù)，已成為一個(gè)亟待解決的難題。在本論文的研究工作中，我們研究和拓展了新型二茂鐵碳硼烷衍生物(FcCB)的生物學(xué)效用，并進(jìn)一步將其用作生物分子探針，實(shí)現(xiàn)了腫瘤細(xì)胞的高靈敏識(shí)別與檢測(cè)。與此同時(shí)，我們采用液滴電化學(xué)系統(tǒng)和光譜學(xué)手段研究了FcCB的電化學(xué)及其光譜學(xué)性質(zhì)，推理了其氧化還原機(jī)制。進(jìn)一步地，采用多種電化學(xué)和光譜學(xué)方法研究了Fc

2、CB與生物大分子的相互作用過程，計(jì)算其結(jié)合位點(diǎn)數(shù)和結(jié)合常數(shù)。在此基礎(chǔ)上，將該生物分子探針用于白血病細(xì)胞的識(shí)別與檢測(cè)，并進(jìn)行了臨床樣本的分析。同時(shí)，論文進(jìn)行了基于電化學(xué)-表面等離子體激元共振技術(shù)(SPR)的細(xì)胞傳感研究，制備了氨基苯硼酸原位修飾的SPR芯片，用于腫瘤細(xì)胞的傳感與分析;使用原位電化學(xué)-SPR技術(shù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)了生物分子探針與腫瘤細(xì)胞相互作用過程，并用于細(xì)胞活性的評(píng)價(jià)。
　　具體內(nèi)容如下:
　　1)碳硼烷衍生物的光電性質(zhì)

3、及其與生物大分子相互作用研究
　　首先構(gòu)建了液滴電化學(xué)系統(tǒng)，以減少樣本的用量，提高檢測(cè)效率。液滴電化學(xué)系統(tǒng)由電化學(xué)單元、XYZ三軸滑動(dòng)平臺(tái)及成像系統(tǒng)組成。使用液滴電化學(xué)系統(tǒng)及光譜方法研究了FcCB的氧化還原性質(zhì)。FcCB具有1對(duì)可逆的氧化還原峰和1個(gè)不可逆的氧化還原峰，分別歸屬于二茂鐵基團(tuán)和環(huán)戊烯結(jié)構(gòu);FcCB的電化學(xué)性質(zhì)與電解質(zhì)的pH值密切相關(guān)，電解質(zhì)溶液的pH值為3.0～8.0時(shí)，峰電位與pH值呈線性關(guān)系，其斜率值接近59 m

4、V/pH單位，說明反應(yīng)過程中質(zhì)子轉(zhuǎn)移數(shù)目和電子轉(zhuǎn)移數(shù)目相等;電化學(xué)及光譜結(jié)果表明FcCB的氧化還原過程涉及兩步單電子-單質(zhì)子轉(zhuǎn)移的氧化還原反應(yīng)。
　　電化學(xué)、紫外光譜及熒光光譜結(jié)果表明FcCB與血紅蛋白具有較強(qiáng)的相互作用，結(jié)合常數(shù)在104 M-1數(shù)量級(jí);FcCB能夠猝滅血紅蛋白的熒光，為動(dòng)態(tài)和靜態(tài)混合猝滅機(jī)制，且靜態(tài)猝滅常數(shù)和動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)接近;當(dāng)FcCB和血紅蛋白濃度比小于2時(shí)，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)為1，結(jié)合常數(shù)為5.67×103 M-1，

5、而FcCB和血紅蛋白濃度比大于2時(shí)，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)為2，結(jié)合常數(shù)為1.06×108 M-1; FcCB能夠結(jié)合到血紅蛋白的疏水區(qū)域，進(jìn)而改變血紅蛋白的構(gòu)象，使其三級(jí)結(jié)構(gòu)變得疏松甚至解聚。
　　2)FcCB生物分子探針在腫瘤細(xì)胞識(shí)別中的應(yīng)用研究
　　拓展了碳硼烷衍生物FcCB的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用，將其用作生物分子探針，用于腫瘤細(xì)胞的識(shí)別與檢測(cè)及臨床樣本分析。與不可逆峰相比，F(xiàn)cCB的可逆峰具有更寬的線性范圍，更低的檢出限，使其在生物傳感

6、檢測(cè)中的應(yīng)用成為可能。研究表明，F(xiàn)cCB與正常及病變的白細(xì)胞作用后，其電化學(xué)響應(yīng)發(fā)生特異性改變。正常組的峰電位相比FcCB本身向負(fù)電位方向移動(dòng)，而白血病組的峰電位則向正電位方向移動(dòng)。因此其峰電位可以用作細(xì)胞識(shí)別與檢測(cè)的特征信號(hào)。多種統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示正常組和白血病組的峰電位位移具有顯著性差異，因此FcCB可以用于臨床樣本的特異性識(shí)別與檢測(cè)。本方法為腫瘤的早期診斷和臨床療效監(jiān)控等方面提供了新的方法與技術(shù)手段，具有潛在而重要的應(yīng)用前景。

7、r>　　3)基于氨基苯硼酸原位修飾的SPR生物傳感研究
　　制備了氨基苯硼酸原位修飾的SPR芯片，接觸角和紅外光譜結(jié)果進(jìn)一步表明氨基苯硼酸修飾到了芯片表面。氨基苯硼酸修飾的SPR芯片對(duì)葡萄糖分子具有良好的檢測(cè)靈敏度，檢出限為0.512mM，同時(shí)能夠進(jìn)行再生進(jìn)而重復(fù)使用。進(jìn)一步地，氨基苯硼酸修飾的SPR芯片可以用于腫瘤細(xì)胞的傳感與檢測(cè)。隨著時(shí)間的增加，HepG2細(xì)胞吸附到芯片表面，SPR響應(yīng)逐漸增大，最后趨于穩(wěn)定，達(dá)到平臺(tái)。隨著細(xì)胞

8、濃度的增加，SPR響應(yīng)達(dá)到平臺(tái)所用的時(shí)間逐漸降低，且參比通道所用時(shí)間大與樣品通道。同時(shí)，HepG2細(xì)胞在樣品通道上的SPR響應(yīng)明顯高于參比通道，樣品通道的檢測(cè)靈敏度遠(yuǎn)高于參比通道。在5×103～1×106細(xì)胞/mL濃度范圍內(nèi)與細(xì)胞的數(shù)量的對(duì)數(shù)值呈正相關(guān)，樣品通道對(duì)HepG2細(xì)胞的檢測(cè)限低于1000細(xì)胞/mL。這種非標(biāo)記、實(shí)時(shí)、快速的檢測(cè)方法對(duì)腫瘤細(xì)胞的傳感與檢測(cè)提供了新的分析手段。
　　4)基于電化學(xué)-SPR技術(shù)的生物活性分子和腫

9、瘤細(xì)胞相互作用的研究
　　采用了電化學(xué)-SPR聯(lián)用方法評(píng)估了柔紅霉素處理后HepG2細(xì)胞的活性。首先優(yōu)化了細(xì)胞芯片的制備條件，進(jìn)而在實(shí)時(shí)記錄SPR響應(yīng)的同時(shí)，采集細(xì)胞外柔紅霉素的電化學(xué)信號(hào)。SPR響應(yīng)來源于SPR芯片表面吸附細(xì)胞形態(tài)和質(zhì)量以及液體環(huán)境折射率等因素的變化，電化學(xué)信號(hào)則歸屬于細(xì)胞外殘留、未被細(xì)胞吸收的柔紅霉素分子。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，細(xì)胞的SPR響應(yīng)及柔紅霉素的電化學(xué)信號(hào)均是濃度和時(shí)間依賴的。隨著柔紅霉素濃度和孵育時(shí)間的增加

10、，細(xì)胞凋亡率增加，有更多的細(xì)胞從SPR芯片上脫落，導(dǎo)致芯片覆蓋率及芯片表面的折射率降低，因此SPR響應(yīng)逐漸降低。同時(shí)，隨著孵育時(shí)間的增加，細(xì)胞吸收培養(yǎng)基中的柔紅霉素分子，使得細(xì)胞外殘留的柔紅霉素含量減小，因此其電化學(xué)信號(hào)發(fā)生降低;另一方面，細(xì)胞凋亡后釋放部分柔紅霉素分子到培養(yǎng)基中，因此隨后的電化學(xué)信號(hào)略有增加。與此同時(shí)，MTT和顯微學(xué)結(jié)果驗(yàn)證了電化學(xué)-SPR的結(jié)果。進(jìn)一步地，SPR響應(yīng)和細(xì)胞存活率呈良好的線性關(guān)系，可以用于評(píng)語細(xì)胞活性。