1、在植物防御病原菌入侵的反應(yīng)過(guò)程中，涉及到植物超敏反應(yīng)、病原菌應(yīng)答基因誘導(dǎo)表達(dá)、多種激素信號(hào)傳導(dǎo)等反應(yīng)。其中SA介導(dǎo)的信號(hào)途徑發(fā)揮重要作用。在前期的研究中，利用基因芯片發(fā)現(xiàn)AAA-ATPase基因家族一個(gè)新成員OsAAA1在SA信號(hào)途徑中起正調(diào)控作用。AAA基因超家族含有一個(gè)保守的ATPase核心結(jié)構(gòu)域和一個(gè)α螺旋，AAA超級(jí)家族C端結(jié)構(gòu)域在A(yíng)TP水解、形成寡聚體、結(jié)合輔助因子過(guò)程中起重要調(diào)節(jié)作用。其核心結(jié)構(gòu)域包含了保守的Walker A

2、和Walker B序列，一個(gè)高度保守的同源次生結(jié)構(gòu)域(SHR)。其中Walker A和Walker B分別是ATP結(jié)合、催化所必須，同時(shí)也用于指導(dǎo)ATP中β-和γ-Pi與Mg的結(jié)合。本文對(duì)OsAAA1的功能進(jìn)行了初步研究，主要內(nèi)容包括如下4個(gè)方面：
　　1）利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化將OsAAA1 RNAi重組載體轉(zhuǎn)入日本晴(NB)愈傷組織中，經(jīng)過(guò)共培養(yǎng)、篩選、分化、生根培養(yǎng)得到轉(zhuǎn)基因苗。經(jīng)過(guò)PCR陽(yáng)性鑒定共得到55株成功插入OsA

3、AA1 RNAi雙鏈的T0代植株，進(jìn)一步對(duì)T1代植株進(jìn)行RNA表達(dá)水平的鑒定，目前得到6株表達(dá)量明顯下調(diào)的T1代植株，并收獲T2代種子。表型鑒定正在進(jìn)行中。
　　2）將融合上GFP的目的基因轉(zhuǎn)化水稻黃化苗原生質(zhì)體中，同時(shí)也將目的基因分別和標(biāo)準(zhǔn)蛋白，包括膜定位蛋白、液泡膜定位蛋白、核定位蛋白共轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體。在激光共聚焦顯微鏡下觀(guān)察目的基因的綠色熒光，液泡膜定位蛋白、膜定位蛋白的紅色熒光，根據(jù)各個(gè)實(shí)驗(yàn)的定位結(jié)果，初步判定目的蛋白OsA

4、AA1定位于細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中。
　　3）構(gòu)建pET-32a-OsAAA1蛋白表達(dá)載體，摸索蛋白最優(yōu)表達(dá)條件，純化可溶性目的蛋白，然后進(jìn)行ATPase酶活測(cè)定。經(jīng)Ni柱純化蛋白，Western blotting進(jìn)一步檢測(cè)表明目的蛋白得到表達(dá)純化，并且單一性較好。將純化蛋白進(jìn)行ATPase酶活檢測(cè)，得到的酶活含量很低，不能用于計(jì)算。目前正在著力解決這一問(wèn)題。
　　4）成功構(gòu)建稻瘟病菌誘導(dǎo)型啟動(dòng)子重組載體PPR1b-ADH-OsA