1、多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida,Pm)是一種重要的畜禽病原菌,屬于巴氏桿菌科,主要使動物發(fā)生傳染性肺炎或出血性敗血病。豬巴氏桿菌病主要有豬傳染性萎縮性鼻炎(Swine infectious atrophic rthinitis,AR)和豬肺疫(Pneumonicpasteurellosis),這兩種疾病給養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
　　 由產(chǎn)毒素多殺性巴氏桿菌(toxigenic Pasteur

2、ella multocida,T+Pm)和支氣管敗血波氏桿菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)引起的豬傳染性萎縮性鼻炎是豬的一種常見且危害嚴(yán)重的傳染病。接種疫苗是預(yù)防和控制AR的主要手段。研究發(fā)現(xiàn),Bb滅活苗中加入從D型T+Pm中提純的毒素制成聯(lián)苗,其免疫效果較常規(guī)的滅活菌苗及單純的類毒素疫苗好,但是提取的巴氏桿菌皮膚壞死毒素(Pasteurella multocida toxin,PMT)在滅活和純化方面沒有

3、得到有效的解決,很難實現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,通過生物技術(shù)手段對巴氏桿菌毒素進(jìn)行分段表達(dá),利用表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行疫苗生產(chǎn)是可行的。
　　 本研究將產(chǎn)毒素多殺性巴氏桿菌HN-13株的toxA基因N端的1140bp片段克隆到原核表達(dá)載體pET-28a系統(tǒng)中,成功構(gòu)建了pET28a-toxAN重組表達(dá)質(zhì)粒,經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá),獲得大小約為45Kda的融合蛋白rtoxAN,經(jīng)Western blot檢測,證實了rtoxAN蛋白具有良好的免

4、疫原性。將此蛋白和滅活的Bb(HH-0809)與白油乳化制成疫苗,進(jìn)行了疫苗對小鼠、仔豬、妊娠母豬的安全性以及對小鼠和仔豬的免疫保護(hù)力研究。同時還開展了從臨床患病豬肺、腎、心、肝、腦和脾等器官中分離鑒定多殺性巴氏桿菌的工作。主要研究內(nèi)容如下:
　　 1.豬多殺性巴氏桿菌的分離鑒定
　　 2010年從530份臨床患病豬肺、腎、心、肝、腦和脾等器官中共分離出148株多殺性巴氏桿菌,其中A型非產(chǎn)毒素多殺性巴氏桿菌68株；D型非

5、產(chǎn)毒素多殺性巴氏桿菌74株；D型產(chǎn)毒多殺性巴氏桿菌3株；未定型的非產(chǎn)毒素多殺性巴氏桿菌3株。
　　 2.PMT毒素的免疫原性研究
　　 (1)參照toxA基因序列(NO.AF240778)設(shè)計引物擴(kuò)增toxA基因N端,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-toxAN,并對其進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),Western blot顯示表達(dá)產(chǎn)物rtoxAN蛋白具有良好的免疫原性,同時對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化。
　　 (2)通過在TSB培養(yǎng)基上增殖培養(yǎng)B

6、b(HH-0809),收集菌液,進(jìn)行細(xì)菌計數(shù)、滅活和濃縮后,和純化好的rtoxAN蛋白一起與白油乳化制成疫苗,此疫苗中Bb含量為2.0×1010 CFU/ml、rtoxAN的含量為100μg/ml。
　　 (3)將試制疫苗以每只0.2ml的劑量接種Balb/C小鼠,接種后定期觀察,小鼠采食、生長均正常,無異常反應(yīng),說明疫苗對小鼠安全。開展了試制疫苗對Balb/C小鼠的免疫保護(hù)力試驗,將32只4周齡Balb/c雌性小鼠隨機分成2組

7、,第1組免疫試制的Bb-toxAN疫苗,第2組注射無菌PBS,首免后2周加強免疫一次。首免后2周、4周分別檢測相應(yīng)的抗體水平。二免后2周,每組一半的小鼠用提取的PMT毒素(6μg)進(jìn)行攻毒,另一半用5.0×106CFU(10×LD50)HH-0809進(jìn)行攻毒,觀察死亡情況。結(jié)果表明,試制疫苗能夠激發(fā)小鼠產(chǎn)生很高的針對Bb和rtoxAN的IgG抗體；攻毒后,此疫苗針對Bb和PMT毒素的保護(hù)率分別為100％和87.5％,而對照組全部死亡。<

8、br>　　 (4)將試制疫苗以每頭4ml的劑量分別接種仔豬和妊娠母豬,接種后定期觀察,仔豬和妊娠母豬采食、生長均正常,無異常反應(yīng),妊娠母豬沒有出現(xiàn)早產(chǎn)、流產(chǎn)等現(xiàn)象。說明疫苗對仔豬和妊娠母豬均安全。將15頭7日齡的仔豬隨機分成3組,第1組免疫制備的Bb-toxAN疫苗,第2組免疫進(jìn)口的豬萎縮性鼻炎苗,第3組注射無菌PBS,首免后2周加強免疫一次。首免后2周、4周分別檢測相應(yīng)的抗體水平。二免后2周,對所有豬只先用Bb(HH-0809)(3