1、目前我國的奶山羊品種與發(fā)達(dá)國家相比差距明顯，缺乏國際競爭力，突出表現(xiàn)為產(chǎn)量奶低，多數(shù)羊的年產(chǎn)奶量不足300kg，經(jīng)濟(jì)效益不高。為解決這一問題，本研究通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育高產(chǎn)奶量的奶山羊。本試驗選取在乳腺發(fā)育和泌乳中起著重要作用的類胰島素生長因子（IGF-1）基因作為轉(zhuǎn)入的目的基因。通過分子生物學(xué)的方法，構(gòu)建了乳腺特異性表達(dá)類胰島素生長因子的載體pIN;然后分別轉(zhuǎn)染人乳腺癌細(xì)胞系(Bcap-37)和山羊乳腺上皮細(xì)胞(GMEC)以驗證乳腺特異

2、性表達(dá)載體pIN表達(dá)IGF-1的能力，進(jìn)一步的研究將載體pIN灌注泌乳期山羊乳腺以驗證其生物學(xué)功能。在確認(rèn)了載體pIN可以表達(dá)IGF-1后，我們使用脂質(zhì)體法將載體pIN轉(zhuǎn)染山羊胎兒成纖維細(xì)胞和小羊耳皮成纖維細(xì)胞，通過抗性篩選和單克隆挑選獲得轉(zhuǎn)IGF-1基因陽性克隆細(xì)胞。將獲得的轉(zhuǎn)IGF-1基因陽性克隆細(xì)胞通過體細(xì)胞核移植技術(shù)移植到去核的卵母細(xì)胞中，融合激活后待其發(fā)育到囊胚期，移植至代孕母羊，最后獲得4只克隆奶山羊。提取克隆奶山羊的血液基

3、因組，通過熒光定量PCR、Southern-blot以及TAIL-PCR等方法一方面鑒定本研究獲得的克隆羊為轉(zhuǎn)IGF-1基因奶山羊，另一方面檢測轉(zhuǎn)IGF-1基因奶山羊中外源IGF-1基因插入的拷貝數(shù)以及部分插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列?？偟膩碚f，轉(zhuǎn)IGF-1基因奶山羊的培育，為通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高山羊奶產(chǎn)量奠定了基礎(chǔ)。本研究中主要試驗內(nèi)容分為以下五部分:
　　1.山羊乳腺特異性表達(dá)載體的構(gòu)建及其驗證
　　本研究的目的是構(gòu)建山羊乳腺特異性

4、表達(dá)載體pIN，并在體內(nèi)體外檢驗載體pIN的生物學(xué)活性，為下一步生產(chǎn)高產(chǎn)奶量轉(zhuǎn)基因奶山羊奠定基礎(chǔ)。第一步，以薩能奶山羊為材料，采用RT-PCR的方法從奶山羊的肝臟組織中擴(kuò)增465bp的類胰島素生長因子1（insulin-likegrowthfactors-1，igf-1）基因;同時以真核表達(dá)載體pCDNA3.1為模板，擴(kuò)增1505bp的真核篩選標(biāo)記neo基因。第二步，以乳腺特異性表達(dá)載體pBC1為骨架載體，先將擴(kuò)增的igf-1基因插入β

5、-酪蛋白5'端啟動子的下游，再將克隆的neo基因克隆到β-酪蛋白3'端終止子的下游，構(gòu)建乳腺特異性表達(dá)載體pIN。第三步，采用脂質(zhì)體法將構(gòu)建好的乳腺特異性表達(dá)載體pIN轉(zhuǎn)染人乳腺癌細(xì)胞系（Bcap-37）和山羊乳腺上皮細(xì)胞，同時使用乳腺灌注法將載體pIN導(dǎo)入泌乳期山羊乳腺組織中去檢測乳腺特異性表達(dá)載體pIN的生物學(xué)功能。體外試驗結(jié)果顯示:在Bcap-37細(xì)胞中，載體pIN轉(zhuǎn)染組的IGF-1蛋白和mRNA表達(dá)量均顯著高于對照組(p＜0.0

6、5）;在山羊乳腺上皮細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染載體pIN的細(xì)胞可以成功誘導(dǎo)表達(dá)IGF-1。體內(nèi)試驗結(jié)果進(jìn)一步證實本研究所構(gòu)建的乳腺特異性表達(dá)載體pIN可以在山羊乳腺組織中成功表達(dá)IGF-1，為增加羊奶產(chǎn)量奠定基礎(chǔ)。
　　2.雙親性小分子DMSO和薄荷醇增加轉(zhuǎn)染效率的研究
　　簡單、快速和高效地將目的基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞核將會有利于加速轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞的篩選過程。轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑的使用可以有效的促進(jìn)外源基因的轉(zhuǎn)運(yùn)。在眾多增強(qiáng)劑中，雙親性小分子化合物二甲基亞

7、楓(DMSO)和薄荷醇可以有效的提高基因的轉(zhuǎn)染效率。本研究首先使用MTT法檢測DMSO和薄荷醇的細(xì)胞毒性，摸索出對細(xì)胞沒有傷害或者傷害很小的最適使用濃度;接著在人乳腺癌細(xì)胞系(Bcap-37)上，使用熒光定量PCR和流式細(xì)胞檢測法去評價DMSO和薄荷醇對轉(zhuǎn)染效率的影響。研究結(jié)果表明2％(V/V)的DMSO和12.5μM薄荷醇可以顯著提高外源基因的轉(zhuǎn)染效率。熒光定量PCR結(jié)果顯示，在薄荷醇后處理和DMSO前處理的Bcap-37細(xì)胞上，生長

8、激素(GH)的mRNA表達(dá)量提高了10倍以上;而在DMSO后處理和薄荷醇前處理的Bcap-37細(xì)胞上，GH的mRNA表達(dá)量則提高了30倍以上。熒光顯微鏡觀察結(jié)果和流式細(xì)胞檢測結(jié)果進(jìn)一步證明DMSO和薄荷醇處理細(xì)胞可以增加表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞數(shù)量。與單獨(dú)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組相比較，DMSO后處理組和薄荷醇前處理組表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞比例增加了15％。進(jìn)一步細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn)，DMSO和薄荷醇處理均可以顯著影響細(xì)胞周期，大大的改變了細(xì)胞周期停滯的比例。這

9、一結(jié)果表明DMSO和薄荷醇可能是通過影響細(xì)胞周期來增加轉(zhuǎn)染效率的?？偟膩碚f，DMSO和薄荷醇處理細(xì)胞均可以顯著增加轉(zhuǎn)染效率，其中DMSO后處理細(xì)胞的方式可以更有效的增加轉(zhuǎn)染效率。
　　3.核定位信號肽增加轉(zhuǎn)染效率的研究
　　轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞篩選效率低下的問題嚴(yán)重限制轉(zhuǎn)基因動物的發(fā)展;其中外源DNA片段（尤其是大分子DNA片段）轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞核是轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞篩選中最重要的限速步驟。研究發(fā)現(xiàn)核定位信號(NLS)可以協(xié)助大分子親核蛋

10、白的入核轉(zhuǎn)運(yùn);補(bǔ)骨脂素(SPB)可以非共價結(jié)合DNA片段以保護(hù)其在轉(zhuǎn)運(yùn)過程中不被核酸酶降解。因此，本研究人工合成經(jīng)典的核定為信號肽“CGGPKKKRKVP(NLS)”以及核定為信號肽-補(bǔ)骨脂素復(fù)合物“SPB-PKKKRKV(SPB-NLS)”去協(xié)助大分子DNA片段的轉(zhuǎn)運(yùn)，希望能夠增加轉(zhuǎn)染效率，繼而可以應(yīng)用到轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞的篩選中去。本研究通過熒光定量PCR，激光共聚焦觀察以及流式細(xì)胞檢測等技術(shù)對NLS及SPB-NLS的生物學(xué)功能進(jìn)行檢測

11、。熒光定量PCR結(jié)果顯示:在NLS和SPB-NLS介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染中，生長激素(GH)的mRNA表達(dá)量分別增加了69％和330％。流式細(xì)胞檢測發(fā)現(xiàn)綠色熒光陽性細(xì)胞的數(shù)量在SPB-NLS組中增加了32.4％;然而在NLS組中，其陽性細(xì)胞的數(shù)量卻減少了75％。進(jìn)一步試驗(western-blot)證實SPB-NLS介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染可以顯著的增加轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)效率（在人乳腺癌細(xì)胞的研究中，SPB-NLS介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染增加了GFP的表達(dá)量;在山羊乳腺上皮細(xì)胞的

12、研究中，SPB-NLS介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染增加了IGF-1的表達(dá)量）。最后，本研究通過激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)SPB-NLS介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染可以增加外源基因如何的效率?？偟膩碚f，本研究證實SPB-NLS是一種優(yōu)良的轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑，很有希望被廣泛用于外源基因的轉(zhuǎn)染以及轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞的篩選。
　　4.轉(zhuǎn)IGF-1基因陽性克隆細(xì)胞的篩選及轉(zhuǎn)IGF-1基因奶山羊的制備
　　轉(zhuǎn)基因動物的制備一直以來就是人們關(guān)注的焦點(diǎn)和難點(diǎn)，尤其是轉(zhuǎn)基因大型家畜的制備。本

13、研究首先分離培養(yǎng)奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞和小羊耳皮成纖維細(xì)胞，摸索不同濃度的G418對兩種細(xì)胞的毒性，選取2周內(nèi)能將細(xì)胞全部殺死的臨界濃度作為抗性篩選濃度（800ng/mLG418:胎兒成纖維細(xì)胞，600ng/mLG418:小羊耳皮成纖維細(xì)胞）。然后通過電轉(zhuǎn)染法將乳腺特異性表達(dá)載體pIN轉(zhuǎn)染到小羊耳皮成纖維細(xì)胞和胎兒成纖維細(xì)胞中去。轉(zhuǎn)染48小時后，更換培養(yǎng)基并添加G418進(jìn)行抗性篩選，篩選10天左右出現(xiàn)明顯的單克隆細(xì)胞團(tuán)。此時將G418的濃

14、度降至維持濃度(300ng/mL)，維持3-5天后，挑取單克隆細(xì)胞至48孔細(xì)胞培養(yǎng)板。待單克隆細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)至6孔板后，將一部分單克隆細(xì)胞提取基因組DNA進(jìn)行PCR驗證，另一部分單克隆細(xì)胞凍存后用于核移植試驗。本試驗共篩選到46個單克隆細(xì)胞株，挑選其中生長狀態(tài)良好的12個單克隆細(xì)胞進(jìn)行PCR鑒定;PCR鑒定結(jié)果顯示igf-1和neo基因整合進(jìn)入細(xì)胞基因組的陽性克隆有2個。挑選驗證陽性的單克隆細(xì)胞進(jìn)行體細(xì)胞核移植制備轉(zhuǎn)IGF-1基因奶山羊。

15、本試驗共獲得4只轉(zhuǎn)IGF-1基因奶山羊。
　　5.轉(zhuǎn)IGF-1基因奶山羊的鑒定
　　轉(zhuǎn)基因動物基因組中不但含有特定的外源基因序列，還包括特定的啟動子、調(diào)控元件和標(biāo)記基因等，這些是進(jìn)行轉(zhuǎn)基因鑒定的基礎(chǔ)。在鑒定轉(zhuǎn)基因動物時，除了檢測外源基因的存在、表達(dá)與否外，還需要對轉(zhuǎn)入基因的完整性、整合位點(diǎn)以及拷貝數(shù)等情況進(jìn)行分析。本研究首先通過普通PCR和Southern-blot鑒定所獲得的克隆羊為轉(zhuǎn)IGF-1基因奶山羊;然后通過絕對熒光

16、定量PCR和熱不均一交錯PCR(TAIL-PCR)進(jìn)一步檢測體細(xì)胞核移植技術(shù)生產(chǎn)的轉(zhuǎn)IGF-1基因奶山羊中插入的外源基因拷貝數(shù)和整合位點(diǎn)。普通PCR檢測結(jié)果表明轉(zhuǎn)IGF-1基因奶山羊基因組中整合有igf-1基因和neo基因;Southern-blot結(jié)果進(jìn)一步證實所獲得的克隆羊為轉(zhuǎn)IGF-1基因奶山羊。絕對熒光定量可以精確的分析外源基因在基因組中的拷貝數(shù)，本研究首先制備標(biāo)準(zhǔn)曲線（log2N（拷貝數(shù)）=-1.0244△Ct+5.3576(

17、R2=0.9963))，接著檢測轉(zhuǎn)IGF-1基因奶山羊中外源IGF-1基因的拷貝數(shù)，結(jié)果顯示4只轉(zhuǎn)IGF-1基因奶山羊中外源基因拷貝數(shù)均為8個拷貝;進(jìn)一步TAIL-PCR成功鑒定了轉(zhuǎn)IGF-1基因奶山羊中外源基因的部分整合位點(diǎn)。3輪特異性的TAIL-PCR得到的多條特異性條帶，經(jīng)測序和BLAST比對得到4個特異性位點(diǎn)，這四個位點(diǎn)分別位于牛基因組的2，11，16和18四條染色體中。本研究初步建立了絕對熒光定量PCR和TAIL-PCR檢測外