1、過量的氨氮流入河流湖泊會引起水體富營養(yǎng)化，并對公眾健康造成威脅。物理化學法處理氨氮廢水往往成本過高，而且會產(chǎn)生有毒的物質和殘留物。近年來，利用微生物的硝化與反硝化作用去除氨氮獲得越來越多的重視。
　　Arthrobacter ureafaciens CZ31是本實驗室從被工業(yè)廢水污染的土壤中篩選得到的高效降解吡啶和氨氮的菌株。研究A.ureafaciens CZ31氨氮降解性能發(fā)現(xiàn)，氨氮初始濃度和碳氮比對菌株降解氨氮的效果影響較大

2、，氨氮初始濃度為2.62g/L時，菌株降解氨氮速率最高，達0.104g·L-1·h-1;碳氮比為20∶1時，菌株氨氮降解率最高，達70.08％;接種量和pH影響較小，不同情況下的降解率相差不大。A.ureafaciens CZ31氨同化作用的主要酶有谷氨酰胺合成酶(GS)、丙氨酸脫氫酶(AlaDH)、谷氨酸脫氫酶(GDH)，其酶學特性的研究結果表明，GS酶活基本不受培養(yǎng)條件的影響，且酶活水平很低;高濃度氨氮時，GDH和AlaDH酶活提高

3、，AlaDH酶活有顯著提升，為探究氨離子對AlaDH酶活的影響在蛋白水平還是轉錄水平，對AlaDH進行異源表達及酶學性質研究。
　　在NCBI上查找同菌屬AlaDH的基因序列，提取A.ureafaciens CZ31基因組，設計引物后PCR擴增得到ald基因，連接至T載體并測序分析發(fā)現(xiàn)該基因全長1119bp，編碼372個氨基酸。蛋白建模得出AlaDH蛋白包含六個亞基，其理論分子量大約為40kDa。亞克隆至質粒pET-28a得到重組

4、質粒pET-28a-ald，轉化至E.coli Rosetta，IPTG誘導后對重組酶進行酶活檢測，比活為2.65U/mg。研究溫度、IPTG濃度、誘導時間對工程菌產(chǎn)酶的影響，并在單因素分析的基礎上進行響應面分析，結果顯示，搖瓶發(fā)酵的最佳條件為:溫度22℃、IPTG0.7mM、誘導時間8h。在此條件下，比活為15.23U/mg，是初始比活的5.75倍。各因素對酶活的影響強度為IPTG濃度＞溫度＞溫度×IPTG濃度＞溫度×誘導時間＞IPT

5、G濃度×誘導時間＞誘導時間。
　　對鎳柱純化后的重組酶進行酶學性質研究發(fā)現(xiàn)，重組酶最適溫度為30℃;最適pH為7;重組酶在0-30℃保溫2h后，酶活保留80％，溫度穩(wěn)定性較好;Ca2+對酶活力具有促進作用，Mg2+、Cu2+、Mn2+、Fe3+對AlaDH的活力均有抑制作用，Zn2+無明顯作用;不同氨離子濃度下酶活無明顯變化。由此推測氨離子對A.ureafaciens CZ31丙氨酸脫氫酶的促進作用在轉錄水平。查找同源菌株丙氨酸脫

6、氫酶上游序列發(fā)現(xiàn)了PucR家族的轉錄調節(jié)因子，設計引物PCR得到該基因，并將其連接至pMD-18T進行測序，蛋白建模發(fā)現(xiàn)其編碼的蛋白具有兩個亞基，每個亞基均含一個結合位點，推測其中一個是氨離子結合位點。
　　A.ureafaciens CZ31能夠高效快捷的降解吡啶和氨氮，對其降解條件探究后能夠更好的用于實際廢水的處理。探究氨離子對A.ureafaciens CZ31丙氨酸脫氫酶的調控機制，發(fā)現(xiàn)了來自PucR家族的轉錄調節(jié)因子，為