1、研究背景:地球上,正常人體的運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)承受兩種刺激:重力(被動(dòng)刺激)和運(yùn)動(dòng)(主動(dòng)刺激)。兩者相結(jié)合、相互作用通過一系列生理、生化過程維持骨組織的結(jié)構(gòu)來適應(yīng)這種力學(xué)環(huán)境。空間飛行中的最重要環(huán)境特征之一就是微重力(失重)。失重是物體只表現(xiàn)為質(zhì)量而不表現(xiàn)為重量的特殊力學(xué)環(huán)境一微重力(10-6-10-9g)環(huán)境,是航空航天過程中人類必須面臨和克服的問題,已有的研究表明,失重可導(dǎo)致心血管系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等的生理甚至病理改變。研究認(rèn)為,上述生

2、理變化的產(chǎn)生是失重通過感覺傳入信息變化、體液頭向轉(zhuǎn)移和重力負(fù)荷力學(xué)作用消失三個(gè)不同層次的生理效應(yīng)發(fā)生作用。
　　 骨質(zhì)疏松是一種常見的代謝性骨病,以單位體積內(nèi)骨量減少,骨礦物質(zhì)沉積減少,而骨的成分含量不變?yōu)樘攸c(diǎn)。骨質(zhì)疏松分為原發(fā)性骨質(zhì)疏松與繼發(fā)性骨質(zhì)疏松。失重性骨質(zhì)疏松屬于繼發(fā)性骨質(zhì)疏松的一種,是以力學(xué)因素為主所致的骨質(zhì)疏松。失重導(dǎo)致骨骼系統(tǒng)病理生理改變的相關(guān)研究表明,長期載人航天飛行中,航天員長時(shí)間生活在太空中,會(huì)因失重導(dǎo)致航

3、天員出現(xiàn)廢用性骨質(zhì)疏松。失重導(dǎo)致的廢用性骨質(zhì)疏松主要表現(xiàn)為骨量丟失、骨礦鹽含量下降、骨密度降低、骨生物力學(xué)性能下降,糞鈣和尿鈣排出量增加,血鈣升高,出現(xiàn)負(fù)鈣平衡。在失重環(huán)境,人體所發(fā)生的一系列適應(yīng)性改變中,大部分系統(tǒng)的變化具有一定自限性,在航天飛行中會(huì)達(dá)到新的平衡狀態(tài),不再繼續(xù)發(fā)展,只有骨骼系統(tǒng)的變化呈現(xiàn)出進(jìn)行性的過程,因此,長期的失重環(huán)境,骨礦鹽的持續(xù)丟失是航天飛行中人類所面臨的嚴(yán)重生理反應(yīng)之一,也是妨礙人類長期太空停留和探索外星球的

4、主要障礙之一。航天醫(yī)學(xué)界非常重視失重條件下骨代謝的研究,雖然進(jìn)行了大量的研究工作,但骨丟失的機(jī)理仍未闡明,雖已采取了各種防護(hù)措施,仍不能有效地防止失重環(huán)境下負(fù)重骨的骨丟失。由于國際空間站的建立、火星探測計(jì)劃的實(shí)施,人類在太空中停留的時(shí)間將進(jìn)一步延長,如沒有有效的防護(hù)措施,骨的持續(xù)大量丟失,有可能導(dǎo)致高鈣血癥、腎結(jié)石、軟組織鈣化、病理性骨折等病理變化。因此,預(yù)防失重狀態(tài)下骨丟失的研究已成為國內(nèi)外航天醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。
　　 人

5、體的骨組織由骨祖細(xì)胞、骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞等構(gòu)成。成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞是骨組織中最重要的力學(xué)感受細(xì)胞,目前大量研究已證實(shí),失重和模擬失重導(dǎo)致的骨丟失是一個(gè)以骨形成抑制起主導(dǎo)作用,并以成骨細(xì)胞數(shù)量減少、骨礦形成障礙和骨成熟延遲為特征的病理生理過程。由于微重力下成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞等缺乏必要的機(jī)械力刺激,使其增殖和分化功能下降,導(dǎo)致成熟成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞數(shù)量減少,骨形成下降,這是造成空間骨丟失的主要因?yàn)?。目前關(guān)于失重性骨丟失的研究焦點(diǎn)和熱點(diǎn)主要

6、是成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞對微重力的響應(yīng)、信號傳導(dǎo)、基因表達(dá)和功能變化等。
　　 研究目的:建立大鼠尾部懸吊模擬失重模型,研究模擬失重對骨組織中細(xì)胞凋亡的影響,并從Fas/FasL途徑上探討失重引起骨組織中細(xì)胞凋亡的機(jī)制。
　　 研究方法:
　　 1、模型制備:5周齡雄性SD大鼠36只隨機(jī)分為(7d、14d及21d)尾吊模擬失重組和相應(yīng)對照組；尾吊模擬失重組大鼠用透氣膠帶粘貼于尾部近2/3部兩側(cè),透氣膠布遠(yuǎn)端懸掛于自由滑

7、動(dòng)的塑料環(huán),使大鼠呈頭低位,身體與地面呈30°,后肢自由懸空不負(fù)重；對照不予處理,于相同籠具等量飲食飼養(yǎng)。
　　 2、對各模型組大鼠反應(yīng)的觀察:觀察尾吊期間大鼠活動(dòng)、飲食、體重變化、皮毛尾部色澤；建模后7d、14d及21d取血清行骨代謝生化指標(biāo)測量,取右側(cè)脛骨近端制備石蠟切片。
　　 3、骨代謝生化指標(biāo)測量:利用美國杜邦(Dimension AR)全自動(dòng)生化分析儀分別測血清鈣(偶氮胂Ⅲ法)、磷(磷鉬酸比色法)、堿性磷酸酶

8、(硝基苯磷酸二鈉比色法)。根據(jù)抗原與抗體競爭性結(jié)合的原理,嚴(yán)格按使用說明操作,用放免法在SN-697型放射免疫分析儀上測骨鈣素。
　　 4、骨組織原位細(xì)胞凋亡檢測:取右側(cè)脛骨近端制備石蠟切片,原位細(xì)胞凋亡檢測技術(shù)檢測骨組織中細(xì)胞凋亡。TUNEL(TdT—mediated dUTP nick endlabeling)技術(shù)原理是生物素標(biāo)記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdTEnzyme)的作用下,可以連接到凋亡細(xì)胞或凋亡小體

9、中由核酸內(nèi)切酶切斷的DNA短鏈的3’末端缺口,并與連接過氧化酶(HRP)或堿性磷酸酶(AP)的鏈霉親和素特異性結(jié)合,后者可催化底物顯色,特異準(zhǔn)確地定位正在凋亡的細(xì)胞,因而在光學(xué)顯微鏡下即可觀察凋亡細(xì)胞。
　　 5、骨組織Fas蛋白含量測定:取右側(cè)脛骨近端制備石蠟切片,免疫組織化學(xué)方法檢測骨組織中Fas蛋白含量。免疫組化是應(yīng)用免疫學(xué)基本原理-抗原抗體反應(yīng),即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理,通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑(酶、金屬離子、

10、熒光素、同位素)顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原(多肽和蛋白質(zhì)),對其進(jìn)行定位、定性及定量的研究。
　　 統(tǒng)計(jì)方法:所有數(shù)據(jù)采用(x)±s表示,用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,組間兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、單向方差分析、重復(fù)測量方差分析及雙因素方差分析(析因分析)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,LSD、SNK多重檢驗(yàn),當(dāng)方差不齊時(shí)選用Dunnea's T3、Dunnett'sC多重檢驗(yàn),P<0.05為差異具有顯著性意義。
　　 研究結(jié)果:

11、　　 1、大鼠尾吊情況:尾吊期間大鼠活動(dòng)、進(jìn)食無受限,無反轉(zhuǎn)咬尾、尾部缺血壞死及感染現(xiàn)象,動(dòng)物成活,懸吊3d后兩組大鼠體質(zhì)量基本保持穩(wěn)定增長。
　　 2、骨代謝生化指標(biāo)測量:7d、14d、21d尾吊模擬失重組大鼠血清中ALP、BGP含量均顯著低于相應(yīng)對照組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；但血Ca、P濃度均較相應(yīng)對照組升高,7d模型組顯著升高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,14d及21d尾吊模擬失重組與相應(yīng)對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 3、骨組織原位細(xì)胞

12、凋亡檢測:正常對照組大鼠脛骨干骺端小梁骨區(qū)域(成骨區(qū))骨小梁排列規(guī)整、陽性染色(深棕色)細(xì)胞核數(shù)量少,而尾吊模擬失重組大鼠脛骨干骺端小梁骨區(qū)域(成骨區(qū))骨小梁變細(xì)、數(shù)量減少、排列紊亂、小梁間隙增寬,可見大量成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞及骨髓間充質(zhì)細(xì)胞核呈陽性染色(深棕色)。各模型組骨組織中成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞及骨髓間充質(zhì)細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯高于相應(yīng)對照組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,隨著尾吊時(shí)間延長,14d、21d模擬失重組骨組織中細(xì)胞凋亡指數(shù)比7d模擬失重組有所下降,

13、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而21d模擬失重組較14d模擬失重組骨組織中細(xì)胞凋亡指數(shù)有所下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 4、骨組織Fas蛋白含量測定:大鼠骨組織Fas染色陽性細(xì)胞范圍廣泛,包括成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞以及骨髓間充質(zhì)細(xì)胞,正常對照組大鼠脛骨干骺端小梁骨區(qū)域(成骨區(qū))骨小梁排列規(guī)整,僅有少量成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞及骨髓間充質(zhì)細(xì)胞胞膜或胞漿呈陽性染色。尾吊模擬失重組脛骨干骺端小梁骨區(qū)域(成骨區(qū))骨小梁變細(xì),數(shù)量減少,排列紊亂,小梁間隙增寬,可

14、見大量成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞及骨髓間充質(zhì)細(xì)胞胞膜或胞漿呈陽性染色,且染色深。各模型組骨組織中Fas蛋白含量均高于相應(yīng)對照組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,且隨著尾吊時(shí)間延長,模擬失重組中Fas蛋白表達(dá)有所減少,各組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 研究結(jié)論:
　　 1、本實(shí)驗(yàn)所建立尾吊模擬失重環(huán)境大鼠模型,成功模擬了體液頭向轉(zhuǎn)移和負(fù)重骨脫負(fù)荷兩個(gè)失重對機(jī)體作用的主要生理效應(yīng),大鼠應(yīng)激反應(yīng)小,為地面模擬失重環(huán)境的研究提供了較好的動(dòng)物模型；
　　

15、2、模擬失重環(huán)境影響骨代謝生化指標(biāo)。血鈣升高,出現(xiàn)負(fù)鈣平衡。
　　 3、模擬失重環(huán)境大鼠骨組織中Fas蛋白的表達(dá)增加。
　　 4、模擬失重環(huán)境誘導(dǎo)骨組織中成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。
　　 5、Fas蛋白的表達(dá)與成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞凋亡率密切相關(guān),由此推斷,模擬失重環(huán)境促進(jìn)了Fas蛋白的表達(dá),從而誘導(dǎo)了骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞的凋亡。
　　 6、隨著尾吊模擬失重時(shí)間延長,骨組織中Fas蛋白表達(dá)及細(xì)胞