1、體細胞核移植（somatic cells nuclear transfer,SCNT）、誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells,iPSCs）和基因編輯等技術(shù)的突破與完善，為醫(yī)學、畜牧業(yè)和生物學基礎研究等帶來了新的曙光。作為一種重要的經(jīng)濟動物，豬在解剖學、生理學等方面比小鼠更接近于人類，正逐漸成為人類異種移植和再生醫(yī)學研究中理想的生物學模型。自SCNT和iPSCs取得成功以來，它們在豬上均有較大發(fā)展，

2、但SCNT還存在效率低和克隆后代死亡率高等問題，而豬iPSCs也存在基因整合等安全性問題。其中，源頭細胞作為兩種重編程技術(shù)中的首個關鍵步驟，適宜的源頭細胞可能為解決重編程中效率和安全等關鍵問題提供思路。
　　本研究首先建立了豬胚胎成纖維細胞系（porcine embryonic fibroblasts,PEFs）和成年豬耳源成纖維細胞系（adult porcineear fibroblasts,APEFs）；并以PEFs、APEF

3、s、仔豬脂肪干細胞系（adipose-derived stem cells,ADSCs）為供體細胞進行SCNT，探討對重構(gòu)胚胎發(fā)育能力的影響；其次，利用多西環(huán)素（DOX）誘導的慢病毒系統(tǒng)將PEFs、APEFs和ADSCs重編程為iPSCs，并對各自的重編程效率進行對比分析。旨在借助SCNT和iPSCs兩種經(jīng)典的細胞重編程方法，綜合考慮各因素，優(yōu)選出供體細胞及其重編程方案；最后，通過原核表達的方法制備具有穿透細胞膜功能的可溶性的EGFP-

4、11R和SOX2-11R重組蛋白，以期為制備其它重組蛋白和以蛋白誘導獲取無基因整合的iPSCs奠定基礎。具體試驗及結(jié)果如下：
　　試驗一成纖維細胞建系和SCNT—通過酶消化、倒置貼壁培養(yǎng)和尼龍網(wǎng)過濾等方法，本實驗室成功構(gòu)建了PEFs，APEFs和ADSCs三株細胞系。在取材方面，因APEFs來自成年公豬耳緣皮膚組織，取材方便、成本低，在動物良種資源保護上具有很大的實際應用價值；ADSCs取自于仔豬背部皮下組織，操作復雜；而PEFs

5、取自于健康懷孕母豬的胎兒，取材和操作繁瑣、成本高。在增殖和細胞狀態(tài)方面，發(fā)現(xiàn)增殖數(shù)率由高到低依次為ADSCs，PEFs和APEFs；ADSCs和PEFs折光性好、形態(tài)飽滿，APEFs狀態(tài)則略差。在作為供體細胞支持重構(gòu)胚發(fā)育方面，以囊胚率做為指標，發(fā)現(xiàn)ADSCs和PEFs顯著高于APEFs（P<0.05）。在重構(gòu)胚質(zhì)量方面，以囊胚總細胞數(shù)為指標，發(fā)現(xiàn)PEFs源重構(gòu)胚的質(zhì)量顯著優(yōu)于APEFs（P<0.05）。
　　試驗二成纖維細胞與A

6、DSCs源豬iPSCs建系—通過DOX誘導的慢病毒系統(tǒng)，成功使三種細胞發(fā)生了重編程過程，且都能觀察到AP陽性克隆。通過對接種細胞數(shù)和克隆總數(shù)的統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)豬ADSCs的重編程效率高于其它兩株成纖維細胞系，與SCNT結(jié)果一致。
　　在PEFs源iPSCs的建立過程中，先后觀察到兩類克隆，這證明重編程是一個逐漸緩慢的過程，持續(xù)的單克隆傳代可能有利于重編程程度的提高。PEFs源iPSCs表現(xiàn)為AP陽性，且在體外培養(yǎng)時無需額外添加藥物D

7、OX；在mRNA水平上，外源性OCT4, SOX2, KLF4和C-MYC表達顯著高于源頭細胞，且內(nèi)源性OCT4, SOX2, KLF4和C-MYC也得到了激活，OCT4和SOX2表現(xiàn)尤為明顯。在蛋白水平上，該株iPSCs表達OCT4和NANOG蛋白。在分化潛能方面，體外能形成擬胚體，形成效率在3％左右。通過逆轉(zhuǎn)錄PCR發(fā)現(xiàn)，外源性基因OCT4、SOX2、KLF4和C-MYC已整合到細胞基因組。
　　試驗三可溶性EGFP-11R和

8、SOX2-11R重組蛋白的制備—依次通過載體構(gòu)建、蛋白表達條件摸索和純化、蛋白鑒定與轉(zhuǎn)導入細胞等步驟，在大腸桿菌提取物的上清中成功獲取且純化出了EGFP-11R和SOX2-11R重組蛋白，且驗證其都具有穿透細胞膜能力。其中，可溶性EGFP-11R重組蛋白的最佳表達條件為37℃和0.5 mol/L IPTG誘導4h，而可溶性SOX2-11R重組蛋白的最佳表達條件為28℃和0.5 mol/L IPTG誘導4h。
　　綜上所述，本研究首

9、先建立了PEFs和APEFs細胞系，發(fā)現(xiàn)APEFs在取材、建細胞系成本、動物福利和良種資源保護方面要優(yōu)于PEFs和ADSCs。然后，同ADSCs一起對三者的重構(gòu)胚胎發(fā)育能力進行檢測，發(fā)現(xiàn)在以囊胚率為指標的重構(gòu)胚發(fā)育方面ADSCs和PEFs要優(yōu)于APEFs，在囊胚質(zhì)量方面，發(fā)現(xiàn)PEFs源囊胚的總細胞數(shù)要高于APEFs源囊胚。此外，利用iPSCs技術(shù)對三種細胞的重編程潛能進行了再次檢測，發(fā)現(xiàn)ADSCs顯著高于PEFs和APEFs，而PEFs