1、本文主要從以下幾個部分展開論述:
　　背景:
　　缺血/再灌注損傷（Ischemia-reperfusion injury,IRI）后心肌細胞壞死、凋亡和心室重構(gòu)是急性心肌梗死溶栓治療和手術(shù)治療后心功能不全的最主要病理生理學(xué)基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)，急性心肌缺血發(fā)生后最終的心肌梗死面積大約50％是由IRI所致。合并糖尿病時更容易發(fā)生心肌IRI，且心臟損傷程度和病死率均進一步明顯增加，嚴重威脅人類生命健康，但機制尚不明確。探討可能的保護

2、措施以達到預(yù)防或減輕心肌IRI的目的，為臨床糖尿病合并缺血性心肌病患者的防治提供理論依據(jù)，具有良好的應(yīng)用前景。
　　缺血預(yù)處理(Ischemic preconditioning，IPC)是指通過多次短暫冠狀動脈缺血以達到增強心肌對隨后長時間缺血的耐受性，從而減輕心肌IRI。IPC強大的心肌保護作用主要表現(xiàn)為縮小IRI后心肌梗死面積、降低心律失常的發(fā)生率、減少心肌細胞凋亡和促進心功能恢復(fù)等。IPC在IRI中發(fā)揮的作用備受人們關(guān)注，但

3、其調(diào)動心肌內(nèi)源性保護作用的機制至今尚未被完全闡明。
　　自噬(Autophagy)是一種細胞內(nèi)防御和應(yīng)激調(diào)控機制，也是參與心肌IRI的重要機制之一。作為一種重要的物質(zhì)代謝方式，自噬的發(fā)生和發(fā)展均受到嚴格的調(diào)節(jié)和控制。自噬是由自噬相關(guān)基因(Autophagy related gene，Atg)進行調(diào)控，其中參與調(diào)節(jié)的幾個關(guān)鍵蛋白復(fù)合物包括雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin，mTOR)、磷脂酰肌

4、醇3激酶(Phosphatidylinositol3kinase-protein kinase，PI3K)、Atg8(LC3)和Atg6(Beclin-1)等。目前已知的自噬調(diào)節(jié)途徑有多條，其中磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B(Protein kinase B)-雷帕霉素靶蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（PI3K-Akt-mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路）是自噬過程中唯一的抑制性通路?，F(xiàn)有的證據(jù)表明，自噬在IRI過程中的作用存在雙面性，發(fā)揮保護作用還是損傷作用目前尚

5、存在爭議。
　　糖尿病嚴重威脅人類的生命健康，不僅是缺血性心臟病的獨立危險因子，而且能夠加重心肌IRI和使IPC等干預(yù)措施對心肌IRI的保護作用消失或減弱。研究發(fā)現(xiàn)，自噬及其相關(guān)的PI3K-Akt-mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在糖尿病心肌的表達發(fā)生了明顯改變，而且它們在正常和糖尿病心肌IRI中所發(fā)揮的作用并不相同。由此可見糖尿病心肌IRI與自噬及其相關(guān)PI3K-Akt-mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)系密切，但具體機制和它們之間的相互作用有待進一步

6、的闡明和研究。
　　基于上述分析，設(shè)計了這個基礎(chǔ)實驗研究，旨在從離體和在體實驗兩個層面觀察PI3K-Akt-mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在正常和糖尿病心肌IRI的表達情況，探討PI3K-Akt-mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和自噬在糖尿病心肌IRI中的作用。同時，在糖尿病心肌IRI實施IPC時分別應(yīng)用自噬激動劑和抑制劑進行干預(yù)，觀察其是否影響IPC對糖尿病心肌IRI的保護作用，以進一步探討自噬調(diào)節(jié)在糖尿病心肌IRI保護機制中的作用。本實驗共分四個部

7、分:
　　第一部分 心肌細胞缺氧/復(fù)氧損傷模型和缺氧預(yù)處理模型的建立
　　本部分實驗的目的是構(gòu)建成熟、穩(wěn)定且高質(zhì)量的原代心肌細胞培養(yǎng)方法，采用三氣培養(yǎng)箱培養(yǎng)構(gòu)建新生鼠離體心肌細胞缺氧/復(fù)氧(Anoxia/reoxygention，AR)損傷模型，并在此基礎(chǔ)上通過觀察心肌細胞凋亡情況，探索最佳的缺氧預(yù)處理方式。
　　結(jié)果顯示，倒置相差顯微鏡下觀察，48～72h后心肌細胞出現(xiàn)同步化搏動，形成功能上的合胞體、收縮有力、活性高

8、。cTnT免疫熒光法復(fù)合細胞核DAPI染色法鑒定的心肌細胞純度達到（94.4±1.2）％。
　　與S組相比，各處理組的心肌細胞LDH漏出率、早期凋亡細胞百分比和晚期凋亡細胞百分比均明顯升高，正常細胞百分比明顯降低。與3h/6h組相比，6h/6h組心肌細胞LDH漏出率、早期凋亡細胞百分比和晚期凋亡細胞百分比均明顯升高，正常細胞百分比明顯降低;30min*3h/6h組，心肌細胞LDH漏出率明顯降低，正常細胞百分比明顯升高。與6h/6h

9、組相比，30min*6h/6h組心肌細胞LDH漏出率、早期凋亡細胞百分比和晚期凋亡細胞百分比均明顯降低，正常細胞百分比明顯升高。
　　第二部分 自噬和PI3K-Akt-mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在缺氧預(yù)處理對高糖心肌細胞缺氧/復(fù)氧損傷保護中作用的實驗研究
　　本部分實驗?zāi)康氖怯^察自噬及其相關(guān)PI3K-Akt-mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在正常和高糖培養(yǎng)心肌細胞缺氧預(yù)處理中的表達，旨在探討缺氧預(yù)處理對高糖心肌細胞缺氧/復(fù)氧損傷保護作用的改變

10、及其相關(guān)機制。
　　結(jié)果顯示:與C組相比，HPC組的心肌細胞LDH漏出率明顯降低（P＜0.01）。與HC組相比，HHPC組的心肌細胞LDH漏出率無顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。與HPC組相比，HHPC組的心肌細胞LDH漏出率明顯升高(P＜0.01)。
　　與C組相比，HPC組的心肌細胞早期和晚期凋亡細胞百分比均明顯降低，正常細胞百分比明顯升高（P＜0.05）。與HC組相比，HHPC組的心肌細胞早期凋亡細胞百分比、晚期凋亡細

11、胞百分比和正常細胞百分比均無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。與HPC組相比，HHPC組早期和晚期凋亡細胞百分比均明顯升高(P＜0.01)。
　　與S組相比，各處理組心肌細胞LC3-Ⅱ表達明顯升高(P＜0.05)，mTOR和PI3K表達明顯降低(P＜0.05);HS組、C組、HC組和HHPC組的Beclin-1表達明顯升高（P＜0.05），P-Akt/Akt比值明顯降低（P＜0.05）。
　　與C組相比，HPC組心肌細胞LC3

12、-Ⅱ和Beclin-1表達明顯降低（P＜0.05），mTOR表達明顯升高(P＜0.05);HC組Beclin-1表達明顯升高(P＜0.05)，mTOR表達明顯降低(P＜0.05)，LC3-Ⅱ表達有升高趨勢但無顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。
　　與HC組相比，HHPC組mTOR表達明顯升高(P＜0.05)，PI3K表達明顯降低(P＜0.05)。與HPC組相比，HHPC組LC3-Ⅱ和Beclin-1表達明顯增加(P＜0.05)，mT

13、OR、PI3K表達和P-Akt/Akt比值明顯降低(P＜0.05)。
　　第三部分:缺血預(yù)處理對正常和糖尿病心肌缺血/再灌注損傷的保護作用和機制
　　本部分實驗旨在觀察自噬在正常和糖尿病心肌IRI后的表達水平，比較IPC對正常和糖尿病心肌IRI的影響，探討自噬在其中的作用。
　　結(jié)果顯示，各組大鼠的一般情況、心肌缺血前血流動力學(xué)參數(shù)基礎(chǔ)值比較差異均無顯著統(tǒng)計學(xué)意義。在缺血期和再灌注期，與C組相比，IPC組發(fā)生室性心律失

14、常的大鼠數(shù)目明顯減少，并且室性心律失常評分降低，DC組發(fā)生室性心律失常的大鼠數(shù)目明顯增多，并且室性心律失常評分增高。與DC組相比，DIPC組發(fā)生室性心律失常的大鼠數(shù)目和室性心律失常評分無明顯差異。
　　第四部分 自噬和PI3K-Akt-mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在缺血預(yù)處理對糖尿病心肌缺血/再灌注損傷保護中作用的實驗研究
　　根據(jù)第三部分的研究結(jié)果，IPC對正常心肌IRI具有保護作用，而對糖尿病心肌IRI無明顯保護性作用，因此設(shè)計

15、了這部分實驗，在IPC中分別采用自噬激動劑（雷帕霉素）和抑制劑（渥曼青霉素）進行干預(yù)，觀察PI3K-Akt-mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和自噬的改變，旨在評價在自噬干預(yù)情況下IPC能否對糖尿病心肌IRI產(chǎn)生保護作用。
　　結(jié)果顯示，各組大鼠的一般情況、心肌缺血前血流動力學(xué)參數(shù)的基礎(chǔ)值比較差異均無顯著統(tǒng)計學(xué)意義。與DS組相比，各處理組IS％值、血清cTnⅠ和CK-MB濃度均明顯升高(P＜0.05)。與DC組相比，Wo+DIPC組IS％值、血

16、清cTnⅠ和CK-MB濃度均明顯降低(P＜0.05);Wo+DIRI組IS％值、血清cTnⅠ和CK-MB濃度均有降低趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);Ra+DIRI組和Ra+DIPC組IS％值、血清cTnⅠ和CK-MB濃度均無顯著差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.通過缺氧6h/復(fù)氧6h能夠成功構(gòu)建離體心肌細胞缺氧/復(fù)氧損傷模型;缺氧30min/復(fù)氧30min后再進行缺氧6h/復(fù)氧6h能夠成功構(gòu)建離體心肌細胞缺氧

17、預(yù)處理模型。
　　2.高糖培養(yǎng)和缺氧/復(fù)氧損傷均可導(dǎo)致心肌細胞自噬抑制性通路PI3K-Akt-mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路表達減弱和自噬相關(guān)激動蛋白表達增強。
　　3.缺氧30min復(fù)氧30min的缺氧預(yù)處理可對正常培養(yǎng)心肌細胞的缺氧/復(fù)氧損傷產(chǎn)生保護作用，且使PI3K-Akt-mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路表達明顯增強;但缺氧預(yù)處理對高糖培養(yǎng)心肌細胞缺氧/復(fù)氧損傷無明顯保護作用，且不影響PI3K-Akt-mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路表達。