1、目的：
　　 環(huán)境激素又稱環(huán)境內(nèi)分泌干擾物（endocrine disrupting chemicals，EDCs），是指一類能使內(nèi)分泌功能發(fā)生變化，并因此而對個體及其子孫產(chǎn)生有害的外源性化學物質(zhì)或混合物。壬基酚(nonylphenol，NP)又稱為壬基苯酚，屬于烷基酚類環(huán)境激素。環(huán)境中的NP主要來源于壬基酚聚氧乙烯醚的降解，壬基酚聚氧乙烯醚因具有強大的脂溶性能夠滲入各種物質(zhì)中，所以被廣泛應用于醫(yī)藥、洗滌劑、塑料、紡織品、化妝品

2、等商品中，因此NP污染范圍較為廣泛。
　　 NP能在生物體中積蓄進而發(fā)揮其毒性作用，有研究表明，NP能干擾生殖器的早期發(fā)育，降低雌性動物的生育指數(shù)和雄性動物的精子存活率;通過消化道積蓄于肝臟和腦后，能夠破壞肝臟中超氧化物歧化酶和過氧化氫酶等抗氧化物質(zhì)，損傷神經(jīng)細胞，甚至能夠通過胎盤影響仔鼠的學習記憶能力;有研究報道壬基酚乙氧基化物對兩棲動物心室細胞心肌膜的超微結構具有損傷作用。
　　 心肌缺血再灌注損傷（myocardi

3、al ischemia reperfusion injury，MIRI）是冠心病治療后容易產(chǎn)生的一種較為嚴重的心肌損傷，目前認為MIRI主要與鈣超載、自由基爆發(fā)、能量代謝、細胞因子和炎癥反應等相關。流行病學研究表明，人類對缺血性心臟病的易感與環(huán)境激素的污染密切相關，但是NP等環(huán)境內(nèi)分泌干擾物是否加重豚鼠離體心臟缺血再灌注損傷目前尚無研究報道。
　　 17β-雌二醇（17β-estradiol，E2）是天然雌激素中活性最強的一種，

4、能夠恢復缺血再灌注損傷后的心功能，緩解心肌損傷。NP具有雌激素樣作用，其化學結構與E2相似，可競爭性抑制E2與靶器官雌激素受體（Estrogen receptor，ER）結合。NP與ER結合后，通過環(huán)磷酸腺苷依賴的信號傳導通路，作用于受體，啟動一系列雌激素依賴性生理生化過程;亦可通過在不同的靶器官組織中改變雌激素細胞核激素受體的活性，干擾內(nèi)生的雌激素作用，包括增強或抑制內(nèi)源性雌激素的活性。有研究報道，NP與E2聯(lián)合使用后能夠增強E2的雌

5、激素作用，但是否能夠干擾E2對缺血再灌注損傷的保護作用，目前尚無研究報道。
　　 Langendorff灌流裝置是研究離體心臟缺血再灌注常用的方法，該法通過配制與血液成分相似的灌流液進行主動脈逆行灌流離體心臟的冠狀動脈模擬心臟在體功能。因能夠排除心臟在體條件下神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用而被廣泛應用于藥物對心臟作用等研究中。然而利用Langendoff灌流研究缺血再灌注損傷的方法中仍存在一些問題:如缺血再灌注損傷模型中缺血時間的選取、心臟

6、缺血再灌注后進行TTC染色最適宜的觀察時間和Langendorff灌流系統(tǒng)的穩(wěn)定性等。
　　 因此基于以上疑問，本研究首先通過制備豚鼠離體心臟缺血再灌注模型，明確該模型中TTC染色法的適宜觀察時間及計算方法，并確定適宜的缺血時間。其次，通過觀察離體豚鼠心功能等指標確定NP直接灌流心臟是否能對心臟產(chǎn)生毒性作用和NP作用于缺血再灌注期間能否加重離體心臟缺血再灌注損傷，并進一步探索NP是否能夠干擾E2對豚鼠離體心臟缺血再灌注損傷的保護

7、作用。
　　 方法：
　　 豚鼠離體心臟進行Langendorff灌流，①分為Control和I30R60組，將心臟橫切為5片，棄去心耳片后，由心耳往心尖方向依次記為第1片、第2片、第3片、第4片并進行TTC染色，分別于染色后4個時間點（1、2、3、4周）對4個橫切片進行逐個觀察，并通過統(tǒng)計前2片、前3片和前4片的方法計算梗死面積百分比;②分為Control、I30R60組、I40R60組、I50R60組，觀察不同缺血組

8、缺血前及再灌注期間心率(heart rate，HR)和冠脈流量（coronary flow，CF），測定灌流液中乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、肌酸激酶(creatine kinase，CK)漏出量和組織中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondial-dehyde，MDA)含量，并以TTC法測定梗死面積;③分為Control、10-7M NP組、10-5

9、 M NP組，觀察2個濃度NP灌流心臟后HR、CF和灌流液中LDH漏出量的變化;④分為I50R60組、10-7 M NP缺血再灌注組、10-5 M NP缺血再灌注組，觀察2個濃度NP作用后離體心臟在再灌注期間HR、CF、灌流液中LDH、CK漏出量和組織中SOD的變化;⑤分為I50R60組、10-7 M E2組、10-7 M NP+10-7 M E2組、10-5M NP+10-7M E2缺血再灌注組，觀察2個濃度NP與10-7M E2聯(lián)合

10、使用后對離體心臟再灌注期間HR、CF、灌流液中LDH、CK漏出量和組織中SOD的影響。
　　 結果：
　　 1、與Control組相比，I30R60組心臟在1周內(nèi)觀察時第1至第4橫切片梗死面積百分比均顯著增加;2周內(nèi)觀察時，第2、3、4橫切片可見明顯梗死區(qū)域;3周內(nèi)觀察時，4個心臟橫切片無統(tǒng)計學差異;4周內(nèi)觀察時，僅第4片具有統(tǒng)計學意義。在計算梗死面積百分比方法中，與Control組相比，I30R60組心臟無論采用前2片

11、、前3片和前4片進行計算，在1周和2周內(nèi)觀察均具有統(tǒng)計學差異，而在3、4周內(nèi)觀察均無明顯差異。
　　 2、與Control組相比，I30R60組各指標尚未全部發(fā)生顯著性變化;I40R60和I50R60組HR和CF降低，梗死面積增大，灌流液中LDH和CK漏出值升高，組織中SOD和MDA值降低;上述所觀察指標中，I50R60組變化更為顯著。
　　 3、10-7 M NP直接灌注離體心臟能在灌流初期顯著提高HR、而對CF和LD

12、H無影響。而10-5M NP能顯著降低HR和CF，并使LDH漏出量顯著升高。
　　 4、10-7M NP和10-5M NP處理I50R60模型結果顯示，2個濃度的NP對再灌注期間HR無影響，CF基本不變，而10-5M NP的CF改變率也僅在再灌初期有所降低，2個濃度NP不影響I50R60模型的梗死面積百分比，10-5M NP均能夠顯著降低再灌注第5 min的LDH值，但隨灌注時間的延長，LDH漏出量逐漸上升，而10-5MNP組降

13、低再灌注第40 min和60 min的LDH值。隨著NP濃度的升高，SOD值明顯降低。
　　 5、10-7M E2能夠升高再灌期間的HR，對CF無明顯影響，但能夠減少梗死面積，降低再灌注期間的LDH和CK值，且能夠降低心肌組織中的SOD值。2個濃度NP分別與E2聯(lián)合使用作用于缺血再灌注模型后均能逆轉E2對心臟再灌注HR的提高作用，且能使梗死面積增加。10-7M E2和10-5M NP聯(lián)合組能明顯升高再灌期間的LDH和CK值的漏出

14、量，提示10-5M NP可能干擾10-7M E2對豚鼠離體心臟缺血再灌注損傷的保護作用。
　　 結論：
　　 1、用TTC染色法評價豚鼠離體心臟缺血再灌注損傷時，可以采用單片或多片心臟橫切片評估梗死程度，并且需要在染色后2周內(nèi)觀察為宜。
　　 2、豚鼠離體心臟缺血再灌注損傷受缺血時間的影響，豚鼠離體心臟缺血再灌注損傷模型的建立以缺血50 min為宜，再灌注時間可考慮限制于15 min至60 min之間。