1、豬流感是由豬流感病毒(Swine influenza virus，SIV)引起的一種急性、熱性、高度傳染性呼吸系統(tǒng)疾病。豬流感病毒亞型眾多，變異速度快，廣泛流行于包括我國(guó)在內(nèi)的世界各地養(yǎng)殖場(chǎng)豬群中，給全球養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前疫苗接種仍是防控豬流感的最有效手段。在保證疫苗安全性的前提下，為了提高豬流感疫苗的保護(hù)效果，本研究分別制備了表達(dá)SIV血凝素(HA)基因的活病毒載體疫苗rSMX△TK△gI/gE-optiHA和利用桿狀病

2、毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)并純化的HA蛋白制備的亞單位疫苗，并對(duì)兩者的單獨(dú)及聯(lián)合免疫效果進(jìn)行初步研究。通過(guò)將兩種疫苗單獨(dú)或配合使用，測(cè)定各組體液免疫和細(xì)胞免疫水平、攻毒后的病理?yè)p傷情況、體重丟失以及存活率等方面來(lái)比較不同免疫策略下保護(hù)效果的差異，以期找到免疫效果最佳的疫苗組合，為豬流感疫苗的研發(fā)提供可靠的數(shù)據(jù)支持。本研究主要內(nèi)容如下:
　　1.表達(dá)SIV HA基因的重組變異偽狂犬病病毒rPRV-HA的制備
　　本研究以變異偽狂犬病病毒基

3、因缺失毒株(rSMX△gI/gE△TK)為載體，以密碼子優(yōu)化的H1N1亞型豬流感病毒HA基因?yàn)槟康幕?，采用同源重組的方法，成功構(gòu)建了重組病毒rSMX△TK△gI/gE-optiHA，并對(duì)獲得的重組病毒在多種細(xì)胞上的增殖特性、一步生長(zhǎng)曲線(xiàn)、遺傳穩(wěn)定性以及對(duì)小鼠的安全性等生物學(xué)特性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，rSMX△TK△gI/gE-optiHA能夠穩(wěn)定表達(dá)HA蛋白。該重組病毒在ST、PK-15、Vero和BHK-21細(xì)胞上的毒價(jià)均高于107

4、.0TCID50/0.1mL，并且在PK-15細(xì)胞上的毒價(jià)達(dá)108.0TCID50/0.1mL。一步生長(zhǎng)曲線(xiàn)結(jié)果表明，該重組病毒的增殖特性與親本毒株一致。連續(xù)傳代20代后，HA基因未發(fā)生變異，表明該重組病毒具有良好的遺傳穩(wěn)定性，并且對(duì)小鼠安全性良好。
　　2.HA蛋白亞單位疫苗的制備
　　本研究采用經(jīng)典的Bac-to-Bac桿狀病毒真核表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)HA蛋白。將SIV HA基因的信號(hào)肽及胞外域片段克隆到轉(zhuǎn)移載體pFastBa

5、c HT B中，獲取重組質(zhì)粒pFastBac HT B-HA。將鑒定正確的重組質(zhì)粒pFastBac HT B-HA轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)三次藍(lán)白斑篩選得到含HA基因的重組桿狀病毒質(zhì)粒rBacmid-HA。隨后，將重組桿粒rBacmid-HA轉(zhuǎn)染至sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞中，獲得重組桿狀病毒rAcMNPV-HA，傳代3次后，用sf9細(xì)胞進(jìn)行重組蛋白的優(yōu)化表達(dá)。SDS-PAGE和Wstern blotting結(jié)果顯示，重組蛋白在

6、培養(yǎng)上清和細(xì)胞內(nèi)均表達(dá)，且培養(yǎng)上清中的蛋白，即分泌蛋白均以糖基化形式存在;而在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的蛋白多以非糖基化形式存在。
　　3.兩種豬流感基因工程疫苗單獨(dú)及聯(lián)合免疫效果研究
　　在成功制備了活病毒載體疫苗rSMX△gI/gE△TK-optiHA和HA蛋白亞單位疫苗的基礎(chǔ)上，本研究將4周齡健康雌性BLAB/c小鼠隨機(jī)分為8組，其中3個(gè)實(shí)驗(yàn)組和5個(gè)對(duì)照組，每組10只，空白對(duì)照組（非免疫不攻毒）每組5只。采取皮下注射的免疫方式進(jìn)行r

7、SMX△TK△gI/gE-optiHA活病毒載體疫苗的單獨(dú)免疫、HA蛋白亞單位疫苗的單獨(dú)免疫以及rSMX△TK△gI/gE-optiHA活病毒載體疫苗和HA蛋白亞單位疫苗的聯(lián)合免疫，同時(shí)設(shè)置親本病毒載體對(duì)照組，DMEM對(duì)照組、佐劑對(duì)照組、滅活疫苗對(duì)照組以及空白對(duì)照組（詳細(xì)分組見(jiàn)表3-6）。每組共免疫2次，間隔4周。分別在首免后第0、2、4和6周采血檢測(cè)SIV ELISA抗體、PRV ELISA抗體、SIV HI抗體以及細(xì)胞因子IFN-γ

8、，并于加強(qiáng)免疫2周后，在乙醚麻醉下，用H1N1(F9)(LD50為102.38TCID50)通過(guò)滴鼻方式進(jìn)行攻毒，劑量為50ul/只。攻毒后連續(xù)14d每日稱(chēng)量每只小鼠的體重，并觀(guān)察小鼠臨床表現(xiàn)及統(tǒng)計(jì)死亡情況。結(jié)果顯示，rSMX△TK△gI/gE-optiHA活病毒載體疫苗單獨(dú)免疫、HA蛋白亞單位疫苗的單獨(dú)免疫以及兩種疫苗聯(lián)合免疫均能夠刺激小鼠產(chǎn)生特異性體液免疫應(yīng)答及細(xì)胞免疫應(yīng)答;rSMX△TK△gI/gE-optiHA的單獨(dú)免疫效果最佳