1、馬凡氏綜合征(MFS)是由于編碼原纖維蛋白-1的基因突變而導致的一種常染色體顯性遺傳結締組織病，由此引發(fā)的主動脈瘤破裂是患者死亡的主要原因。現(xiàn)有的手術治療及藥物治療效果不甚理想，亟需在MFS發(fā)病機理的研究上產(chǎn)生突破，以期找到更為精準有效的治療方法。主動脈中層的平滑肌細胞以及彈力纖維層是主動脈壁維持正常生理功能的基本單位，中層的平滑肌細胞的凋亡、功能失常以及彈力纖維的降解是MFS主動脈瘤發(fā)生發(fā)展的主要原因。因此，研究導致平滑肌細胞行為異常

2、以及彈力纖維層斷裂崩解的原因成為MFS升主動脈瘤發(fā)病機理的主要研究方向。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類長度超過200nt的非蛋白編碼RNA，近年來的研究表明，lncRNA廣泛參與基因的表觀遺傳調(diào)控、基因轉錄和轉錄后調(diào)節(jié)以及miRNA的調(diào)控等生物學過程，且已有研究證實某些lncRNA在平滑肌行為的調(diào)控方面展現(xiàn)著重要的作用。而lncRNA在MFS血管病變中的研究尚未見相關報道，鑒于其在心血管發(fā)育以及平滑肌行為調(diào)控方面所展現(xiàn)出的多樣化

3、的調(diào)控機制，我們認為在MFS血管病變的發(fā)生發(fā)展過程中，某些lncRNA起著至關重要的調(diào)控作用。本課題利用人的組織樣本，通過芯片高通量篩選差異表達的mRNA和lncRNA，進一步運用生物信息學分析的方法找到與MFS升主動脈瘤發(fā)生發(fā)展密切相關的lncRNA，重點研究其在調(diào)控主動脈平滑肌行為和重構血管平滑肌細胞外基質中的作用，找到一個導致MFS發(fā)生血管病變的關鍵信號通路，從而確定新的、特異、敏感的治療靶點，為實現(xiàn)MFS的精準治療，改善MFS臨

4、床治療現(xiàn)狀提供堅實的理論基礎。
　　研究內(nèi)容主要包含以下三個部分
　　第一部分 MFS升主動脈組織mRNA及l(fā)ncRNA表達譜檢測及相關的生物信息學分析
　　實驗組選取10例MFS患者，在外科手術時獲取升主動脈組織。對照組組織來源于冠狀動脈硬化患者，在接受搭橋手術主動脈壁打孔時獲取升主動脈組織。所有樣本均在離體后直接放入液氮中凍存。使用TRIZOL法提取總RNA，使用NanoDrop檢測總RNA的純度;利用變性瓊脂糖膠

5、，檢測總RNA的完整性，綜合運用上述方法挑選出總RNA質量最優(yōu)的5組樣本，進行后續(xù)的高通量分析。使用Affymetrix最新高通量芯片HTA2.0(GeneChip Human Transcriptome Array2.0)，檢測兩組升主動脈組織中mRNA以及l(fā)ncRNA的表達情況，對所有芯片數(shù)據(jù)進行三維模型的主成分分析(3D-PCA)，判斷樣本間的離散水平，刪除離散度高的樣本，對剩余數(shù)據(jù)做更進一步的生物信息學分析。用Limma算法篩選

6、兩組之間的差異mRNA及l(fā)ncRNA，對差異表達的mRNA進行功能顯著性分析(GO-Analysis)，得到差異mRNA所顯著影響的功能;對差異mRNA進行信號通路的顯著性分析(Pathway-Analysis)，得到差異基因所參與的顯著性信號轉導通路;以顯著性GO為研究對象，基于GO的層次結構，通過構建功能關系網(wǎng)絡(GO-Trees)，總結實驗影響的功能群體，以及顯著性功能間的內(nèi)在從屬關系;以顯著性Pathway中包含的差異基因為研究

7、對象，構建基因間相互作用關系網(wǎng)絡(Gene-Act-Net)，從而得到差異基因構成的信號轉導關系網(wǎng)絡以及差異基因中位于中樞位置的核心調(diào)控基因;對顯著性Pathway中包含的差異基因和顯著性GO中包含的差異基因取交集，命名為交集mRNA;以交集mRNA和差異lncRNA為研究對象，通過基因自身的實測表達值構建基因間的共表達網(wǎng)絡(Co-expression-Network)，從網(wǎng)絡中確認處于疾病關鍵調(diào)控環(huán)節(jié)的lncRNA。運用熒光定量PCR

8、(qRT-PCR)驗證相關的lncRNA以及mRNA的表達。
　　在MFS升主動脈組織中，研究共篩選到顯著差異表達的602個mRNA以及376個lncRNA(Fold change＞1.5，P＜0.05)，功能顯著性分析(GO-Analysis)結果顯示，差異表達的mRNA主要參與炎癥反應、細胞外基質重構等相關的生物學進程;差異基因的信號通路生物信息學分析結果顯示，PPAR以及一些代謝相關的信號通路發(fā)生了顯著下調(diào)的改變，而ECM-

9、receptor interaction、proteindigestion and absorption、PI3K-AKT以及TGF-β等信號轉導通路則出現(xiàn)了顯著上調(diào)的改變。通過構建相應的mRNA-lncRNA共表達網(wǎng)絡及計算差異K-core值，我們發(fā)現(xiàn)lncRNA NR024430極有可能在MFS血管病變的發(fā)生發(fā)展中起關鍵性的調(diào)控作用，且進一步的qRT-PCR驗證了lncRNA_024430在MFS升主動脈組織中的顯著下調(diào)。
　

10、　第二部分 lncRNA NR_024430在MFS血管病變發(fā)生發(fā)展中的作用和具體機制
　　該部分利用入主動脈原代平滑肌細胞(sciencell6110)對lncRNA NR_024430的功能及起作用的具體機制進行深入探討。利用RNA原位雜交技術(RNA-FASH)研究了lncRNA NR_024430在原代平滑肌細胞中的定位;運用反義核苷酸技術(antisense oligonucleotides，ASOs)，敲低原代平滑肌細

11、胞中的lncRNANR_024430，研究其在原代平滑肌中的功能;利用RNA測序技術（RNA-Seq），結合相關的生物信息分析方法，深入探討研究lncRNA NR_024430所影響的下游分子及生物學功能，并使用qRT-PCR技術驗證NR_024430所影響的下游的信號分子。利用體外轉錄技術結合高通量蛋白組學技術(HuProt2.0)，需找NR_024430所能調(diào)節(jié)的具體蛋白調(diào)節(jié)因子，深入探討其起作用的具體分子機制。研究進一步使用重組人

12、TGF-β1刺激人主動脈原代平滑肌細胞，探討NR_024430所參與的信號轉導通路與非經(jīng)典TGF-β信號通路之間的關系。
　　研究結果顯示，lncRNANR_024430表達定位于原代主動脈平滑肌的細胞核內(nèi)，RNA-Seq的結果顯示，敲低原代主動脈平滑肌細胞中的NR_024430，顯著增加到了平滑肌細胞的凋亡率（P＜0.05），且可以促進平滑肌細胞分泌相關的炎癥細胞因子，促進平滑肌細胞分泌基質金屬蛋白酶-1、9(MMP-1、9)，

13、而這些改變均為MFS血管病變發(fā)生發(fā)展中的關鍵生物學事件。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，NR_024430所參與的調(diào)節(jié)過程，獨立于非經(jīng)典的TGF-β信號轉導通路，且兩條通路互為補充，均在MFS主動脈瘤的進展中起重要的作用。蛋白組學的結果顯示與NR_024430相互結合蛋白大部分為轉錄因子，我們推測NR_024430的分子生物學功能很有可能與這些轉錄因子的調(diào)控息息相關。
　　第三部分 MFS中平滑肌狀態(tài)行為的改變
　　該部分使用MFS小鼠模

14、型FBN1 C1039G/+，結合HE染色及免疫熒光染色技術，觀察MFS小鼠升主動脈平滑肌細胞的形態(tài)改變;運用TUNEL技術，檢測MFS小鼠升主動脈平滑肌細胞凋亡情況;使用qRT-PCR技術，檢測人升主動脈組鈣相關蛋白mRNA表達的變化;利用Fluo-4標記細胞胞漿鈣，結合激光共聚焦顯微鏡，檢測MFS小鼠升主動脈平滑肌細胞鈣庫鈣含量的變化。
　　研究結果顯示，MFS小鼠升主動脈平滑肌排列明顯異常，出現(xiàn)簇狀聚集現(xiàn)象，平滑肌細胞凋亡顯

15、著，且人MFS組織中ryr2的表達顯著下調(diào)，鈣庫檢測結果顯示MFS平滑肌細胞內(nèi)鈣庫鈣含量明顯多于正常對照。
　　結論:
　　1.lncRNANR_024430在MFS升主動脈組織中顯著下調(diào)。
　　2.NR_024430主要表達于原代主動脈平滑肌細胞的細胞核。
　　3.NR_024430參與了MFS主動脈瘤的發(fā)生發(fā)展。
　　4.敲低NR_024430可以誘導原代主動脈平滑肌細胞發(fā)生凋亡。
　　5.敲低N

16、R_024430可以促進原代主動脈平滑肌細胞分泌相關的炎性細胞因子。
　　6.敲低NR_024430可以促進原代主動脈平滑肌細胞分泌基質金屬蛋白酶-1、9(MMP-1、9)，這些酶與主動脈中層彈力纖維的降解息息相關。
　　7.TGF-β1可以促進原代主動脈平滑肌細胞分泌MMP-2。
　　8.NR_024430所參與的調(diào)節(jié)過程，獨立于非經(jīng)典的TGF-β信號轉導通路，且兩條通路互為補充，均在MFS主動脈瘤的進展中起重要的作