1、豬鏈球菌2型（Streptococcus suis type2，SS2）可引起豬患腦膜炎、關節(jié)炎、心內膜炎、肺炎及敗血癥，同時也能感染人并導致死亡，是一種重要的人畜共患病病原體。豬痘病毒（Swinepox virus，SPV）在自然情況下只感染豬，并且癥狀溫和，能自行康復，其作為病毒載體有很多優(yōu)點，故適合用于重組疫苗的開發(fā)。本研究以SPV作為載體構建了6個表達SS2保護性抗原的重組病毒，并對重組病毒進行了免疫學評價。
　　 1.

2、 SPV的分離及豬痘的血清學調查
　　 用PK-15細胞在豬痘發(fā)病豬的痂皮和膿皰中分離到一株SPV。對包含SPV特異性序列在內的三段核酸序列進行了擴增和測序，與SPV17077-99株相比，三段序列的核苷酸同源性分別為91％、96％和99％。此外，為了了解豬痘的流行現(xiàn)狀，利用瓊脂擴散試驗對來自江西、安徽、湖北、江蘇、廣東及上海共1004份成年豬血清進行了豬痘血清學調查。結果表明，豬痘在豬群中較少發(fā)生，在被檢測的1004份樣品中只

3、有40份陽性，陽性率僅為4％,但被調查的六個地區(qū)都有分布。
　　 2.表達lacZ基因重組豬痘病毒的構建及其生物學特性研究
　　 為了驗證兩個痘苗病毒（Vaccinia virus，VV）強啟動子P11和P28在重組豬痘病毒中的活性，構建了一個載體系統(tǒng)。利用這個系統(tǒng)獲得了兩個重組豬痘病毒rSPV-Z11和rSPV-Z28，并對這兩個重組病毒的生物學特性進行了研究。在這個系統(tǒng)中，SPV基因組中SPV020和SPV021兩基

4、因間的366bp非編碼區(qū)作為產(chǎn)生重組豬痘病毒的一個新的外源基因插入位點，大腸桿菌的lacZ基因作為一個顯性篩選標記。獲得的重組病毒用PCR和SDS-PAGE進行了鑒定，并對重組病毒在PK-15細胞中的增殖能力和親本毒株進行了比較，同時我們也分析了重組病毒的遺傳穩(wěn)定性。結果顯示，lacZ基因在重組病毒中穩(wěn)定存在并能得到有效表達，重組病毒的滴度及蝕斑大小和親本病毒差異不大，說明重組病毒性狀穩(wěn)定，該366bp非編碼區(qū)的部分刪除對病毒增殖影響不

5、大，并且啟動子P11和P28在重組病毒中有很強的活性，適合用于構建疫苗用的重組豬痘病毒。
　　 3.表達綠色熒光蛋白的重組豬痘病毒的構建及其在鼠源細胞系中的復制和表達
　　 為了探討小鼠作為豬痘病毒載體疫苗免疫學評價模型的可能性，構建了一個表達綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)的重組豬痘病毒rSPV-G28，并對重組病毒在鼠源細胞系LLC和Hepa1-6中的復制和表達情況進行了研究

6、。結果顯示，rSPV-G28在這兩個鼠源細胞中能夠有效表達綠色熒光蛋白，并且重組病毒能在LLC細胞中復制并產(chǎn)生子代病毒，表明小鼠可作為豬痘病毒載體疫苗免疫學評價的動物模型。
　　 4.表達豬鏈球菌2型mrp基因片段的重組豬痘病毒的構建及免疫學評價
　　 為了探討SPV作為鏈球菌疫苗載體的潛力，構建了一個用于獲得表達外源基因的重組豬痘病毒的載體系統(tǒng)，并用這個系統(tǒng)得到了一個表達豬鏈球菌2型mrp基因片段的重組豬痘病毒rSPV

7、-MRP。通過PCR、western blotting和間接免疫熒光檢測對rSPV-MRP進行了鑒定。經(jīng)肌肉注射，分別用rSPV-MRP、SS2滅活疫苗（陽性對照）、SPV親本病毒（陰性對照）及PBS（空白對照）給CD1小鼠免疫3次。在最后一次免疫后的第14天，用致死劑量或亞致死劑量的SS2強毒菌株ZY05719攻擊CD1小鼠。結果顯示，rSPV-MRP免疫組60％的小鼠存活，顯著高于陰性對照組(P＜0.05)。并且，rSPV-MRP免

8、疫組的小鼠各器官細菌含量顯著低于陰性對照組（P＜0.05）。rSPV-MRP免疫組的MRP特異性抗體滴度在檢測的所有時間點都顯著高于對照組(P＜0.001)。這些數(shù)據(jù)表明，rSPV-MRP能顯著保護CD1小鼠抵抗SS2強毒菌株的感染。因此，重組豬痘病毒有望成為豬鏈球菌疫苗用于預防豬發(fā)生鏈球菌感染。
　　 5.共表達豬鏈球菌2型SLY和MRP重組豬痘病毒的構建及其在CD1小鼠模型中的保護效率研究
　　 利用GFP基因作為篩

9、選標記構建了一個用于獲得表達外源基因的重組豬痘病毒的載體系統(tǒng)，并用這個系統(tǒng)得到了兩個表達SS2保護性抗原的重組豬痘病毒rSPV-SLY和rSPV-SLY-MRP。通過肌肉注射，分別用rSPV-SLY、rSPV-SLY-MRP、SS2滅活疫苗（陽性對照）、SPV親本病毒（陰性對照）及PBS（空白對照）給CD1小鼠免疫3次。在最后一次免疫后的第14天，用致死劑量或亞致死劑量的SS2強毒菌株ZY05719攻擊CD1小鼠。分別在免疫的0、7、1

10、4、21、28、35、42及49天粟血用于測定小鼠的SLY和MRP特異性抗體水平。結果顯示，重組病毒免疫組的特異性抗體在一免后的第7天就顯著升高，且在加強免疫后持續(xù)上升。在免疫后的所有測定點，重組病毒免疫組的抗體滴度均顯著高于陰性對照組（P＜0.001），也明顯高于陽性對照組(P＜0.05)。數(shù)據(jù)還顯示，重組病毒免疫組的小鼠各器官細菌含量顯著低于陰性對照組（P＜0.05）;rSPV-SLY免疫組和rSPV-SLY-MRP免疫組的攻毒保護

11、率分別70％和100％。這些數(shù)據(jù)表明，重組豬痘病毒rSPV-SLY和rSPV-SLY-MRP能顯著保護CD1小鼠抵抗SS2強毒菌株的感染，可作為豬鏈球菌疫苗的候選物。
　　 6.共表達豬鏈球菌2型ECE、MRP和SLY重組豬痘病毒的構建及其在CD1小鼠模型中的保護效率研究
　　 利用豬痘病毒作為載體構建了三個表達SS2保護性抗原的重組病毒rSPV-ECE、rSPV-ECE-SLY和rSPV-ECE-MRP-SLY。經(jīng)肌肉

12、注射，分別用 rSPV-ECE、rSPV-ECE-SLY、rSPV-ECE-MRP-SLY、SS2滅活疫苗（陽性對照）、SPV親本病毒（陰性對照）及PBS（空白對照）給CD1小鼠免疫3次。在最后一次免疫后的笫14天，用致死劑量或亞致死劑量的SS2強毒菌株ZY05719攻擊CD1小鼠。分別在免疫的0、7、14、21、28、35、42及49天采血用于測定SS2保護性抗原的特異性抗體水平。結果顯示，重組病毒免疫組的特異性抗體在一免后的第7天就

13、顯著升高，且在加強免疫后持續(xù)上升。在免疫后的所有測定點，重組病毒免疫組的抗體滴度均顯著高于陰性對照組（P＜0.001），也明顯高于陽性對照組(P＜0.05)。數(shù)據(jù)還顯示，重組病毒免疫組的小鼠各器官細菌含量顯著低于陰性對照組(P＜0.05);rSPV-ECE免疫組的攻毒保護率為60％，rSPV-ECE-SLY免疫組和rSPV-ECE-MRP-SLY免疫組的攻毒保護率均為100％。這些數(shù)據(jù)表明，表達SS2保護性抗原的重組豬痘病毒能顯著保護C