1、目的: 動脈粥樣硬化嚴重威脅人類健康，是威脅人類健康的主要原因，在我國動脈粥樣硬化的發(fā)病率呈逐年增高的趨勢。血管平滑肌細胞(VSMC)的增生和遷移，是形成動脈粥樣硬化發(fā)生的重要因素之一。血小板源性生長因子(PDGF)是一個主要的促細胞分裂原，是引起動脈粥樣硬化的主要因素，它的主要作用是促進平滑肌細胞由中層向內(nèi)層的遷移。PDGF-BB是已知最強的VSMC體外趨化劑。Rho激酶(ROCK)是小G蛋白下游的效應器之一，有兩種異構體：R

2、OKα/ROCK-Ⅱ和ROKβ/ROCK-I。大量研究表明，RhoA/Rho激酶介導的信號轉(zhuǎn)導通路參與了眾多血管生理功能的調(diào)節(jié)，如細胞骨架重組、平滑肌收縮、細胞增生、黏附和遷移以及其他炎性反應過程，而這些細胞功能又與許多血管疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關。因此，Rho激酶有望成為治療動脈粥樣硬化、再狹窄、高血壓、腦或冠脈血管痙攣等血管疾病的重要靶點。 本文旨在探討ROCK-Ⅱ在血小板源性生長因子(PDGF)誘導的VSMC遷移中的作用。

3、通過應用RNA干擾技術，使ROCK-Ⅱ基因表達下調(diào)，從而觀察VSMC遷移是否發(fā)生變化，進而為探尋平滑肌收縮的分子機制提供實驗依據(jù)，為臨床防治動脈粥樣硬化等增生性血管病的新藥研發(fā)提供新思路。 方法: 1．根據(jù)在GenBank中查到大鼠ROCK-Ⅱ基因序列(GenBankNM-013022)，自行設計siRNA片段序列，采用化學合成法合成siRNA(編號為CBR0915)。同時，在實驗中還使用由本實驗室從Santa Cruz

4、公司購置的小鼠ROCK-Ⅱ siRNA(sc-36433)。 2．采用invitrogen公司的脂質(zhì)體LipofectamineTM 2000，將siRNA轉(zhuǎn)染至VSMC內(nèi)，同時使用綠色熒光素標記的Control siRNA(Fluorescein Conjiugate)轉(zhuǎn)染細胞，熒光顯微鏡下觀察siRNA轉(zhuǎn)染狀況，計算轉(zhuǎn)染效率并確定轉(zhuǎn)染時間，通過脂質(zhì)體毒性實驗，確定最佳的轉(zhuǎn)染試劑用量。 3．用RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，

5、逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR擴增后進行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察電泳結(jié)果并拍照，分析并計算目的條帶與GAPDH擴增條帶光密度比值作為其相對表達強度。 4．收集細胞，提取總蛋白并測蛋白濃度，電泳轉(zhuǎn)膜后，經(jīng)過抗體孵育，化學反光法檢測蛋白條帶，進行灰度值分析，計算ROCK-Ⅱ與β-actin比值。 5．采用Boyden小室法進行VSMC的遷移實驗，在實驗中，設空白對照組(未轉(zhuǎn)染組)、脂質(zhì)體組(僅加入脂質(zhì)體組)和RNA干擾組，觀

6、察RNA干擾ROCK-Ⅱ基因表達前后A7r5遷移數(shù)量的變化。 結(jié)果: 1．在熒光顯微鏡下，觀察熒光素標記的Control siRNA轉(zhuǎn)染組細胞，可見到細胞質(zhì)內(nèi)清晰的綠色熒光，在轉(zhuǎn)染5小時后，脂質(zhì)體LipofectamineTM2000的轉(zhuǎn)染效率接近92％。 2．在脂質(zhì)體毒性實驗中，加入1.7μ1脂質(zhì)體使A7r5細胞減少了46.9％，加入2.5μ1脂質(zhì)體使細胞減少了66.2％。 3．經(jīng)過RT-PCR檢測，得

7、到如下結(jié)果：(1)用小鼠siRNA不能下調(diào)ROCK-Ⅱ mRNA的表達，實驗組和對照組相比無顯著差異(P>0.05)；(2)用17nM大鼠siRNA可以使ROCK-Ⅱ mRNA表達量減少了60.3％(P<0.05)。提示大鼠siRNA可以有效抑制ROCK-Ⅱ基因的表達。 4．Western blot結(jié)果顯示：(1)小鼠siRNA不能下調(diào)ROCK-Ⅱ蛋白表達，統(tǒng)計學分析顯示實驗組與對照組相比無顯著差異(P>0.05)；(2)17n

8、M大鼠siRNA可使ROCK-Ⅱ蛋白表達量減少了60.1％。提示大鼠ROCK-ⅡsiRNA可以有效抑制ROCK-Ⅱ蛋白的表達。 5．VSMC的遷移實驗結(jié)果顯示：(1)通過不同濃度PDGF-BB誘導A7r5細胞遷移，根據(jù)細胞遷移數(shù)量，確定了PDGF-BB誘導劑使用濃度為5ng/ml。(2)在A7r5細胞遷移實驗中，空白對照組A7r5細胞遷移數(shù)為70.2±8.81(n=3)，脂質(zhì)體組A7r5細胞遷移數(shù)為59.3±6.22(n=3)，

9、17nMsiRNA組A7r5細胞遷移數(shù)為60.1±4.11(n=3)。實驗表明加入大鼠ROCK-ⅡsiRNA后細胞遷移數(shù)量較空白對照組和單純用脂質(zhì)體組均未見明顯變化。統(tǒng)計學分析顯示無顯著性差異(P>0.05)。 結(jié)論: 1．確定了ROCK-Ⅱ siRNA的最佳用量為17nM，最佳轉(zhuǎn)染時間為5小時。 2．利用自行設計針對大鼠ROCK-Ⅱ的siRNA轉(zhuǎn)染A7r5血管平滑肌細胞，在基因水平和蛋白質(zhì)水平進行檢測，發(fā)現(xiàn)可以