1、本實驗首先從“Havana SRI”煙草品種中克隆了CycB基因并構(gòu)建了植物過表達載體。然后通過農(nóng)桿菌介導的方法進行了煙草的遺傳轉(zhuǎn)化。通過PCR、Southern分子雜交和Northern分子雜交對轉(zhuǎn)基因植株進行了鑒定。為了比較轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株的地上部分的生長量、葉片在組織培養(yǎng)條件下的生長和分化及其兩種類型植株中DNA的含量。Northern雜交分析了CycB基因在野生煙草的不同組織(莖端、嫩葉、花芽和根)中的表達情況。
　

2、　 同時對煙草遺傳瘤中CycB基因的表達進行了研究。首先從粉藍煙草(Nicotiana.glauca)中得到了遺傳瘤(NG),從粉藍煙草x郎氏煙草(N.langsdorffii)的雜交種中得到雜交瘤(H)。然后比較了遺傳瘤株系(NG1-NG4)和雜種瘤株系(H1-H3)形態(tài)學、組培條件下生長率和對植物植物生長調(diào)節(jié)劑的敏感性幾方面的差異。最終通過Northern探討了它們中CycB基因的表達情況。
　　 上述研究得到的具體結(jié)果如

3、下:
　　 1、煙草中CycB基因的過量表達研究
　　 (1)成功構(gòu)建了CycB植物表達載體,通過農(nóng)桿菌介導的方法進行煙草轉(zhuǎn)基因,進行PCR、Southern雜交和Nouthern雜交都證實了轉(zhuǎn)基因的真實性,并且證明轉(zhuǎn)基因植株中CycB基因的表達信號很強,但在是對照中其表達水平低到幾乎檢測不到。
　　 (2)用Northern雜交實驗來檢測煙草植株不同部位的CycB基因的表達情況。雜交的結(jié)果表明CycB基因的表達

4、呈現(xiàn)出組織特異性:在莖端和花芽高水平表達,而在葉片和根部位幾乎不表達。
　　 (3)取生長了六周的轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株,測量其地上部分高度。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因植株在生長速率上與野生型對照間并無明顯的區(qū)別。
　　 (4)利用流式細胞儀對細胞中DNA的含量進行測定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株有著與野生型對照相似的細胞含量分布。說明CycB基因的組成型表達并沒有誘導細胞周期的明顯變化。
　　 (5)在含有外源植物生長調(diào)節(jié)劑(細胞

5、分裂素和生長素)的培養(yǎng)基上,野生型和轉(zhuǎn)基因的葉片均能產(chǎn)生不定芽；但當不含任何植物生長調(diào)節(jié)劑時,野生型和轉(zhuǎn)基因的葉片的生長情況差異極大,20％的轉(zhuǎn)基因葉仍能生成不定芽,而野生型葉片則退化死亡。
　　 (6)轉(zhuǎn)基因煙草根毛發(fā)育與對照存在較大的差異。轉(zhuǎn)基因煙草的根毛與對照相比則更濃密而且更長。
　　 2、粉藍煙草遺傳瘤的形成及植物生長調(diào)節(jié)劑IAA和6-BA對其的影響
　　 (1)粉藍煙草幼苗在MS培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)兩個月

6、,可在根部產(chǎn)生遺傳瘤。這表明粉藍煙草的腫瘤發(fā)生可能跟營養(yǎng)物質(zhì)的缺失或一些抑制性的代謝物的積累造成的脅迫有關(guān)。
　　 (2)粉藍煙草遺傳瘤可在無任何植物生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基上繼續(xù)分化,而正常粉藍煙草開片在無任何植物生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基上容易褐化死亡。
　　 (3)四個遺傳瘤株系(NG1-NG4)與三個雜交瘤株系(H1-H3)產(chǎn)生的幼苗有相似的特征,都表現(xiàn)為部分有組織腫塊,這些組織上都帶有萌芽狀態(tài)的葉芽或莖產(chǎn)生。掃描電鏡觀察到雜

7、交瘤生成的幼苗葉片比遺傳瘤有更多的葉表皮毛。
　　 (4)三個不同的雜交瘤株系(H1-H3)以及四個不同遺傳瘤株系(NG1-NG4)在不添加任何植物生長調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)10天和30天時,所有幼苗的生長相對同步,且都表現(xiàn)出了較高的生長率,生物量測定結(jié)果顯示它們之間沒有顯著差異。
　　 (5)遺傳瘤幼苗與雜交瘤幼苗在含有植物生長調(diào)節(jié)劑IAA(0.1 mg/L,1.0 mg/L)和BA(0.1 mg/L,1.0 mg/