1、目的：
　　應(yīng)用含補(bǔ)腎中藥血清研究補(bǔ)腎方對人胚胎干細(xì)胞體外分化為類卵泡結(jié)構(gòu)的研究。
　　方法：
　　以H9人胚胎干細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對象，誘導(dǎo)H9細(xì)胞形成擬胚體(EB)，加入含22、23、24、25、26、27＃方的含藥血清，血清濃度為3％；另以分化誘導(dǎo)因子骨形成蛋白4(BMP4)作為陽性對照，BMP4終濃度為100pg/ml；以不加BMP4的完全培養(yǎng)液作為空白對照。顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察H9擬胚體生長和分化的形態(tài)學(xué)變化；采用實(shí)時(shí)熒光

2、定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)技術(shù)檢測EB和分化細(xì)胞生殖分化標(biāo)志基因的表達(dá)；采用免疫熒光技術(shù)檢測生殖細(xì)胞分化相關(guān)的標(biāo)志蛋白表達(dá)；應(yīng)用酶聯(lián)免疫(ELIS)A技術(shù)定量測定了分化后期培養(yǎng)液中E2含量。
　　實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)均使用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，若同時(shí)滿足正態(tài)分布和方差齊性，則取用 x±s表示，運(yùn)用單因素方法分析和配對T檢驗(yàn)進(jìn)行檢測。
　　結(jié)果：
　　1.含補(bǔ)腎中藥血清誘導(dǎo)H9擬胚體生長及分化
　　1.

3、1各含藥血清組可明顯促進(jìn)EB的生長和誘導(dǎo)EB分化，在誘導(dǎo)分化第3天出現(xiàn)與陽性對照類似的早期分化特征：大量細(xì)胞從EB游離，EB逐漸縮小呈不規(guī)則形；同時(shí)收集EB及游離細(xì)胞檢測胚胎干細(xì)胞分化標(biāo)志基因Oct-4 mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示：加入含藥血清前其Oct-4基因大量表達(dá)，加入含藥血清培養(yǎng)第3天，各組EBOct-4 mRNA明顯下調(diào)，表明含補(bǔ)腎中藥血清在短期內(nèi)即啟動(dòng)EB分化。
　　1.2進(jìn)一步檢測了與生殖發(fā)育相關(guān)的基因表達(dá)，各含藥血清

4、組對生殖分化相關(guān)基因的表達(dá)有明顯差異,其中23＃含藥血清在誘導(dǎo)GDF9、ZP1和SCP3的表達(dá)均強(qiáng)于BMP4。進(jìn)一步采用免疫熒光技術(shù)檢測了23＃含藥血清組誘導(dǎo)EB分化第5天GDF9的蛋白表達(dá)。與mRNA水平檢測結(jié)果一致，陰性對照組因具有自發(fā)分化特性，GDF9有較弱表達(dá)；BMP4和23＃含藥血清誘導(dǎo)的GDF9表達(dá)明顯增強(qiáng)，且23＃含藥血清優(yōu)于BMP4。
　　2.含補(bǔ)腎中藥血清誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞向生殖特異性組織細(xì)胞分化
　　2.1

5、含藥血清誘導(dǎo)分化5-7天，BMP-4陽性對照組和23、25、26＃含藥血清組均可觀察到一類明顯大于其它分化類型的細(xì)胞，該類該細(xì)胞直徑大于50μm，形態(tài)酷似類卵細(xì)胞。繼續(xù)延長培養(yǎng)分化時(shí)間至7-10天，類卵細(xì)胞直徑增加，其邊緣逐漸形成細(xì)小顆粒；誘導(dǎo)分化至11-16天，類卵細(xì)胞邊緣的顆粒層隨時(shí)間延長而增厚，胞體直徑均大于100μm，某些顆粒層呈現(xiàn)扁平狀結(jié)構(gòu)。推定這類被顆粒細(xì)胞層包裹的細(xì)胞為類卵泡結(jié)構(gòu)（follicle-like structu

6、res, FLSs）。
　　為了證實(shí)含藥血清誘導(dǎo)分化的類卵泡結(jié)構(gòu)，選擇23＃含藥血清誘導(dǎo)分化并持續(xù)16天，在顯微鏡下觀察和記錄了FLSs形成的動(dòng)態(tài)變化。綜合分析結(jié)果顯示，含藥血清以及BMP4可在5-16天內(nèi)，誘導(dǎo)H9胚胎干細(xì)胞形成至少3種FLSs結(jié)構(gòu)，包括從始基卵泡（primordial follicles）→初級卵泡（primary follicles）→次級卵泡（secondary follicles）的發(fā)育。
　　2.

7、2補(bǔ)腎中藥誘導(dǎo)分化類卵泡形成的分子標(biāo)志物鑒定
　　2.2.1原始卵泡期的分子標(biāo)志物分析
　　為了進(jìn)一步證實(shí)類卵泡結(jié)構(gòu)的形成，選擇23＃含藥血清，培養(yǎng)H9細(xì)胞3-7天，在原始卵泡形成數(shù)量較多時(shí)，應(yīng)用RT-qPCR技術(shù)檢測原始卵泡形成過程中3種分子標(biāo)志物表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化。23＃含藥血清在誘導(dǎo)分化3、5、7天，均上調(diào)GDF9和SCP3的表達(dá)，呈現(xiàn)時(shí)間依賴性；23＃含藥血清也誘導(dǎo)VASA表達(dá)，但在分化第7天表達(dá)下調(diào)。GDF9和SCP3

8、表達(dá)的時(shí)間依賴性與原始卵泡在體外分化發(fā)育的時(shí)間基本一致；VASA基因在誘導(dǎo)分化第7天表達(dá)下調(diào)，提示VASA的表達(dá)與始基卵泡發(fā)育有關(guān)。另選擇23＃含藥血清誘導(dǎo)培養(yǎng)第7天的原始卵泡，檢測了GDF9的蛋白表達(dá)，與基因表達(dá)水平一致，在單個(gè)類卵泡結(jié)構(gòu)中顯示較強(qiáng)的熒光信號。
　　2.2.2生長卵泡期的分子標(biāo)志物分析
　　另收集培養(yǎng)7-16天的分化細(xì)胞，檢測了生長卵泡形成期間3種分子標(biāo)志物表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化。23＃含藥血清誘導(dǎo)分化7、9、11

9、天，均上調(diào)ZP1、ZP2和ZP3表達(dá)，并呈現(xiàn)時(shí)間依賴性。對23＃含藥血清誘導(dǎo)培養(yǎng)第11天的生長卵泡，檢測了ZP1的蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示在單個(gè)生長卵泡結(jié)構(gòu)的顆粒層與卵母細(xì)胞之間有較強(qiáng)的熒光信號。
　　2.3補(bǔ)腎中藥誘導(dǎo)的卵母細(xì)胞發(fā)育的形態(tài)學(xué)特征
　　原始卵泡和生長卵泡期的卵母細(xì)胞為初級卵母細(xì)胞，具有減數(shù)分裂I各期特征，為了證實(shí)含藥血清誘導(dǎo)的初級卵母細(xì)胞形成的減數(shù)分裂I特征，采用免疫熒光技術(shù)，應(yīng)用β-actin染色細(xì)胞骨架，Hoe

10、chst33258染色減數(shù)分裂各期的核結(jié)構(gòu)，以此鑒定被顆粒層包裹的類卵母細(xì)胞。結(jié)果顯示，23＃血清誘導(dǎo)分化7-16天的類卵細(xì)胞包括有卵原細(xì)胞和處于細(xì)線期、偶線期、粗線期的初級卵母細(xì)胞；在含藥血清誘導(dǎo)分化過程中偶見處于雙線期的卵母細(xì)胞。這從減數(shù)分裂前各期的形態(tài)學(xué)特征進(jìn)一步證實(shí)了補(bǔ)腎中藥可誘導(dǎo)類卵泡結(jié)構(gòu)形成。
　　2.4補(bǔ)腎中藥誘導(dǎo)分化形成的前顆粒細(xì)胞分子標(biāo)志物及功能評價(jià)
　　2.4.1前顆粒細(xì)胞分子標(biāo)志物分析
　　收集誘

11、導(dǎo)第11天的分化細(xì)胞，檢測了顆粒細(xì)胞標(biāo)志物FSHr mRNA的表達(dá)，其中23＃含藥血清組FSHr mRNA表達(dá)明顯高于BMP4陽性對照。特針對23＃含藥血清誘導(dǎo)培養(yǎng)第11天的生長卵泡，檢測了Aromatase的蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示在單個(gè)生長卵泡結(jié)構(gòu)外緣的顆粒層有較強(qiáng)的熒光信號。
　　2.4.2前顆粒細(xì)胞功能評價(jià)
　　向各組培養(yǎng)液中添加終濃度為50ng/ml的睪酮，收集誘導(dǎo)分化第9和11天的培養(yǎng)液，檢測培養(yǎng)液中E2的表達(dá)情況：在

12、誘導(dǎo)分化第9天，23＃含藥血清組其培養(yǎng)上清中的E2濃度顯著高于陰性對照組，略低于BMP4組；在誘導(dǎo)分化第11天，23＃含藥血清組其培養(yǎng)上清中的E2濃度明顯增加，顯著高于BMP4組。在誘導(dǎo)分化第11天，向各組培養(yǎng)液中加入終濃度為0.1IU/mL的FSH，培養(yǎng)48h后，各組培養(yǎng)液中E2濃度均較添加FSH之前明顯升高，23＃含藥血清組中E2濃度顯著高于BMP4組，提示BMP4和23＃含藥血清誘導(dǎo)分化的類卵泡結(jié)果具有一定的功能。
　　結(jié)論

13、：
　　1.本研究培養(yǎng)的EB處于未分化狀態(tài),且具有多能性；含補(bǔ)腎中藥的血清可明顯促進(jìn)EB生長，并在短期內(nèi)啟動(dòng)分化程序，表明補(bǔ)腎中藥具有快速誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞體外分化的能力。
　　2.含補(bǔ)腎中藥血清可促進(jìn)人胚胎干細(xì)胞體外分化為類卵泡結(jié)構(gòu)，包括由始基卵泡→初級卵泡→次級卵泡的發(fā)育，但在本實(shí)驗(yàn)條件下，未觀察到成熟卵泡的形成。表明含藥血清可誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞形成類卵泡結(jié)構(gòu)，但FLSs的發(fā)育停留在竇前卵泡階段。
　　3.誘導(dǎo)分化的類

14、卵泡結(jié)構(gòu)中的卵母細(xì)胞具有減數(shù)分裂I的形態(tài)特征，包括卵原細(xì)胞和處于細(xì)線期、偶線期、粗線期的初級卵母細(xì)胞。
　　4.誘導(dǎo)分化的類卵泡結(jié)構(gòu)中逐漸生成的前顆粒細(xì)胞具有合成雌激素的功能，對FSH有明顯反應(yīng)。
　　綜上，通過含補(bǔ)腎中藥血清體外誘導(dǎo)人胚干細(xì)胞分化的研究為表明，補(bǔ)腎中藥具有誘導(dǎo)人胚干細(xì)胞分化為類卵泡結(jié)構(gòu)，具有合成雌激素的功能。本研究應(yīng)用人胚胎干細(xì)胞成功誘導(dǎo)分化為類卵泡結(jié)構(gòu)為首次報(bào)道，為人胚干細(xì)胞的生殖細(xì)胞定向分化以及補(bǔ)腎中藥