1、研究背景與目的：
　　膿毒癥是機(jī)體對(duì)感染產(chǎn)生的全身性炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致膿毒癥休克和多器官功能衰竭。據(jù)全美流行病學(xué)的調(diào)查研究統(tǒng)計(jì)，膿毒癥患者中有40％～50%合并心肌功能受損，其中出現(xiàn)嚴(yán)重心力衰竭者約占7%。膿毒癥心肌病所導(dǎo)致的心肌損傷是重癥膿毒癥患者死亡的重要原因。有研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥引起機(jī)體的免疫系統(tǒng)的過度應(yīng)答，尤其是巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的大量的炎癥因子和活性氧簇，對(duì)心肌細(xì)胞產(chǎn)生不可逆轉(zhuǎn)的損傷。并且有研究指出，心肌細(xì)胞的損傷，尤其是心肌收

2、縮功能受限和心肌細(xì)胞凋亡，是引起心臟功能不全的重要原因。
　　曲美他嗪（Trimetazidine，TMZ），臨床上常用的治療心絞痛的藥物。曲美他嗪通過抑制心肌β氧化途徑的關(guān)鍵酶——長(zhǎng)鏈-3-酮酰輔酶 A硫解酶，使心肌能量代謝由游離脂肪酸氧化代謝供能為主，轉(zhuǎn)變?yōu)橛善咸烟茄趸┠転橹?，是其緩解心絞痛的藥理作用機(jī)制。正常心肌能量代謝60%-70%來自于脂肪酸β氧化，20%-25%來自葡萄糖的氧化代謝，5%-10%來自糖酵解。而脂肪酸β

3、氧化產(chǎn)生等量的ATP耗氧量要比葡萄糖氧化代謝高。在心肌缺血缺氧時(shí)，曲美他嗪能夠增加葡萄糖的利用，抑制脂肪酸氧化，進(jìn)而提高心肌細(xì)胞產(chǎn)生能量的效率。近年來，有文獻(xiàn)報(bào)道，曲美他嗪通過緩解氧化應(yīng)激，減輕炎癥來改善左心室重塑。而在膿毒癥心臟病中，曲美他嗪能否發(fā)揮作用尚無文獻(xiàn)報(bào)道。因此在本研究中，我們采用脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠模型，探討曲美他嗪對(duì)膿毒癥心肌損傷是否有保護(hù)作用。并在體外利用巨噬細(xì)胞和心

4、肌細(xì)胞，研究曲美他嗪對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生及其介導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的作用及可能的分子機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果：
　　1.首先，我們采用C57BL/6小鼠，通過腹腔注射LPS建立膿毒癥的動(dòng)物模型。根據(jù)曲美他嗪（TMZ）處理時(shí)間的不同，我們分別采用了兩種模型，第一種為TMZ預(yù)處理模型：即在LPS誘導(dǎo)前三天給予TMZ灌胃處理；第二種為TMZ治療模型：即在LPS誘導(dǎo)6小時(shí)后給予TMZ灌胃處理。通過心臟超聲和Millar

5、導(dǎo)管血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)，評(píng)價(jià)小鼠的心功能。結(jié)果表明，無論是在TMZ預(yù)處理模型還是TMZ治療模型中，TMZ均能顯著緩解LPS引起的心臟功能受損，包括提高左心室射血分?jǐn)?shù)和縮短分?jǐn)?shù)，降低左室內(nèi)徑和左室舒張末期壓，增加左心室壓力上升速率。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn) TMZ治療模型中，TMZ明顯緩解LPS引起的低血壓，增加LPS所誘導(dǎo)的膿毒癥心肌病小鼠的存活率。
　　2.對(duì)于TMZ預(yù)處理模型，LPS注射6小時(shí)后，留取心肌組織和血漿。采用心肌TUNEL染色和

6、 F4/80免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)心肌細(xì)胞的凋亡和心臟巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)。應(yīng)用real-time RT-PCR和ELISA檢測(cè)心肌組織和血漿中的促炎細(xì)胞因子的表達(dá)。結(jié)果表明，在膿毒癥小鼠心臟中，心肌細(xì)胞凋亡增加，血漿和心臟中的炎癥因子（TNFα, MCP-1, IL-1β, IL-6）顯著增加，同時(shí)伴隨著巨噬細(xì)胞在心臟中的聚集增多。而TMZ明顯緩解了心肌細(xì)胞的凋亡，降低血漿和心臟組織中炎癥因子的產(chǎn)生，減少巨噬細(xì)胞的聚集。
　　3.為了明

7、確TMZ影響巨噬細(xì)胞的募集是作用在心臟，還是骨髓，我們進(jìn)行了骨髓移植實(shí)驗(yàn)。將未處理（WT）或者TMZ預(yù)先灌胃的小鼠的骨髓移植到經(jīng)亞致死量放射線照射后的WT或者TMZ組老鼠中，構(gòu)建了四種骨髓移植嵌合體模型。即（1）將供體小鼠（對(duì)照組，WT）的骨髓提取出來，經(jīng)尾靜脈注射入經(jīng)亞致死劑量放射線照射受體小鼠（對(duì)照組，WT）體內(nèi)（WT>WT組）；（2）將供體小鼠（對(duì)照組，WT）的骨髓提取出來，經(jīng)尾靜脈注射入經(jīng)亞致死劑量放射線照射受體小鼠（在骨髓移植

8、前三天，進(jìn)行TMZ灌胃組）體內(nèi)（WT>TMZ組）；（3）將供體小鼠（在骨髓移植前三天，進(jìn)行 TMZ灌胃組）的骨髓提取出來，經(jīng)尾靜脈注射入經(jīng)亞致死劑量放射線照射受體小鼠（對(duì)照組，WT）體內(nèi)（TMZ>WT組）；（4）將供體小鼠（在骨髓移植前三天，進(jìn)行 TMZ灌胃組）的骨髓提取出來，經(jīng)尾靜脈注射入經(jīng)亞致死劑量放射線照射受體小鼠（在骨髓移植前三天，進(jìn)行TMZ灌胃組）體內(nèi)（TMZ>TMZ組）。再用LPS誘導(dǎo)膿毒癥模型。LPS注射6小時(shí)后，通過心臟

9、超聲和Millar導(dǎo)管血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)，評(píng)價(jià)小鼠的心功能。隨后留取心肌組織，采用蘇木素-伊紅觀察心肌結(jié)構(gòu)，同時(shí)應(yīng)用F4/80染色觀察心臟巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，以及流式細(xì)胞術(shù)觀察心臟中單核細(xì)胞核巨噬細(xì)胞的聚集情況。
　　結(jié)果顯示，接受TMZ預(yù)先處理的骨髓移植的小鼠（即TMZ>WT和TMZ>TMZ組）表現(xiàn)出較好的心功能，包括降低的左室的內(nèi)徑和左室舒張末期壓，增加的左心室壓力上升速率和左心室收縮末期壓以及較高的左心室射血分?jǐn)?shù)和縮短分?jǐn)?shù)值。并且TM

10、Z>WT和TMZ>TMZ組心肌細(xì)胞排列整齊，心臟中巨噬細(xì)胞聚集顯著緩解，且巨噬細(xì)胞的降低程度跟其前體單核細(xì)胞降低的程度類似。上述結(jié)果提示提示 TMZ主要通過作用于骨髓源性細(xì)胞，而非心肌細(xì)胞和其他實(shí)質(zhì)性臟器細(xì)胞，減少了膿毒癥小鼠心肌組織中的巨噬細(xì)胞，及其前體單核細(xì)胞的浸潤(rùn)，進(jìn)而改善了膿毒癥心功能損傷。此外，我們還將F4/80染色的巨噬細(xì)胞數(shù)目和心功能指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析。分析結(jié)果表明，心功能的改善和心臟中巨噬細(xì)胞的數(shù)目呈負(fù)相關(guān)。即心臟中巨噬

11、細(xì)胞數(shù)目越多，心功能越差。
　　4.接下來的研究中我們通過流式分選分別獲得了有TMZ預(yù)處理和無TMZ預(yù)處理?xiàng)l件下，LPS誘導(dǎo)的小鼠心臟中的巨噬細(xì)胞。同時(shí)提取了原代腹腔巨噬細(xì)胞，采用TMZ、LPS干預(yù)。應(yīng)用real-time RT-PCR檢測(cè)了分選的心臟巨噬細(xì)胞和干預(yù)的原代腹腔巨噬細(xì)胞中炎癥因子的表達(dá)。結(jié)果顯示 TMZ能夠明顯的減少膿毒癥小鼠心臟巨噬細(xì)胞以及LPS干預(yù)的原代腹腔巨噬細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)，表明TMZ在抑制心臟巨噬細(xì)胞和腹

12、腔原代巨噬細(xì)胞的炎癥因子的產(chǎn)生的效應(yīng)是一致的。鑒于分選的心臟巨噬細(xì)胞數(shù)量極低，因此在接下來的研究中，我們采用了腹腔原代巨噬細(xì)胞作為研究對(duì)象。
　　5.為了進(jìn)一步研究巨噬細(xì)胞是否跟心肌細(xì)胞之間存在交互作用（相互影響），我們將巨噬細(xì)胞跟原代心肌細(xì)胞利用Transwell小室進(jìn)行共同培養(yǎng)。Transwell小室上層的巨噬細(xì)胞經(jīng)過預(yù)先加藥處理（LPS，TMZ，LPS+TMZ和LPS+促炎細(xì)胞因子中和抗體）后，再跟下層的心肌細(xì)胞培養(yǎng)，然后用

13、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)心肌細(xì)胞的凋亡情況。研究結(jié)果表明，LPS處理的巨噬細(xì)胞能明顯增加心肌細(xì)胞凋亡，TMZ預(yù)處理的巨噬細(xì)胞則能顯著降低LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。而LPS+促炎細(xì)胞因子中和抗體組的巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的能力也下降，這一效應(yīng)與TMZ類似，說明TMZ可能通過降低巨噬細(xì)胞中炎癥因子的表達(dá)，從而緩解巨噬細(xì)胞所介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。
　　6.在體外培養(yǎng)的原代腹腔巨噬細(xì)胞中，我們采用TMZ、LPS干預(yù)，同時(shí)加入ROS的清除劑NAC，采

14、用熒光探針DHE檢測(cè)巨噬細(xì)胞活性氧（reactive oxygen species，ROS）的水平，同時(shí)應(yīng)用 real-time RT-PCR檢測(cè)巨噬細(xì)胞的炎癥因子表達(dá)。結(jié)果提示 TMZ降低LPS誘導(dǎo)的ROS的生成和促炎細(xì)胞因子表達(dá)，這一效應(yīng)與加入了ROS的清除劑NAC類似。
　　7.在分子機(jī)制方面，首先在 TMZ預(yù)處理模型留取的心肌組織中，提取蛋白，采用Western blotting檢測(cè)細(xì)胞核和細(xì)胞漿內(nèi)的Sirt1蛋白表達(dá)水平

15、。結(jié)果提示，LPS明顯抑制Sirt1由胞漿進(jìn)入胞核，TMZ顯著增加Sirt1從胞漿進(jìn)入胞核。在體外，以原代腹腔巨噬細(xì)胞作為研究對(duì)象，采用TMZ、LPS和Sirt1抑制劑NAM或轉(zhuǎn)染Sirt1的si-RNA干預(yù)后，通過 Western blotting檢測(cè)細(xì)胞核和細(xì)胞漿內(nèi)的Sirt1以及 NADPH亞基gp91phox和p47phox的蛋白表達(dá)水平，熒光探針DHE檢測(cè)巨噬細(xì)胞內(nèi)ROS的水平，以及real-time RT-PCR檢測(cè)巨噬細(xì)胞

16、的炎癥因子表達(dá)水平。結(jié)果表明，LPS明顯增加巨噬細(xì)胞ROS的生成和促炎細(xì)胞因子的表達(dá)以及gp91phox和p47phox的蛋白表達(dá)，抑制Sirt1由胞漿進(jìn)入胞核。而TMZ顯著的抑制LPS誘導(dǎo)的ROS的生成和促炎細(xì)胞因子的表達(dá)以及gp91phox和p47phox的蛋白表達(dá)，并且增加Sirt1從胞漿進(jìn)入胞核。然而TMZ的抑制LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞ROS介導(dǎo)的炎癥應(yīng)答的這一效應(yīng)，能被Sirt1抑制劑NAM阻斷，說明TMZ通過Sirt1在巨噬細(xì)胞中

17、發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用，并降低炎癥因子的釋放。
　　8.進(jìn)一步，在體外培養(yǎng)的原代腹腔巨噬細(xì)胞中，采用TMZ、LPS和Sirt1抑制劑NAM干預(yù)后，收集蛋白，通過Western blotting檢測(cè)p-AMPK和AMPK的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果表明LPS顯著抑制AMPK的磷酸化水平，TMZ顯著增加LPS抑制的AMPK的磷酸化水平。而加入Sirt1的抑制劑NAM或者轉(zhuǎn)染Sirt1的si-RNA后，TMZ增加AMPK的磷酸化水平被抑制。說明TM

18、Z能夠通過Sirt1影響AMPK的磷酸化水平。同時(shí)，我們還采用了AMPK抑制劑Compound C干預(yù)。干預(yù)后收集蛋白，通過Western blotting檢測(cè)Nrf2和HO-1的蛋白表達(dá)水平。并采用熒光探針DHE檢測(cè)ROS的水平，以及real-time RT-PCR檢測(cè)炎癥因子的表達(dá)。結(jié)果提示TMZ顯著增加LPS抑制的Nrf2和HO-1的表達(dá)水平，降低LPS誘導(dǎo)的ROS的生成和促炎細(xì)胞因子的表達(dá)。而AMPK的抑制劑Compound C

19、逆轉(zhuǎn)了TMZ增加Nrf2和HO-1的表達(dá)的作用，抑制了TMZ的抗氧化應(yīng)激和緩解炎癥因子釋放的作用。以上結(jié)果提示，TMZ通過Sirt1/AMPK，增加Nrf2和HO-1的表達(dá)水平，減少ROS的生成，最終緩解巨噬細(xì)胞的促炎應(yīng)答。
　　9.另一方面，在體外培養(yǎng)的原代腹腔巨噬細(xì)胞中，采用 TMZ、LPS和 Sirt1抑制劑NAM干預(yù)后，收集蛋白，用Western blotting檢測(cè)核PPARα的表達(dá)。結(jié)果表明LPS顯著降低核PPARα的

20、表達(dá)水平。與LPS組相比，TMZ顯著增加巨噬細(xì)胞的核PPARα的表達(dá)。而Sirt1抑制劑NAM部分阻斷了TMZ增加LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的核PPARα的表達(dá)的作用，提示TMZ能夠通過Sirt1影響核PPARα的表達(dá)。進(jìn)一步，采用TMZ、LPS和PPARα拮抗劑GW6471干預(yù)原代腹腔巨噬細(xì)胞后，收集蛋白，用Western blotting檢測(cè)IκBα磷酸化和核p65的表達(dá)水平，同時(shí)，采用熒光探針DHE檢測(cè)ROS的水平，以及real-tim

21、e RT-PCR檢測(cè)炎癥因子的表達(dá)。結(jié)果提示TMZ能顯著降低LPS導(dǎo)致的p-IκBα/IκBα和NF-κB p65的表達(dá)增加，降低LPS誘導(dǎo)的ROS的生成和促炎細(xì)胞因子的表達(dá)。PPARα拮抗劑GW6471部分阻斷了TMZ降低p-IκBα/IκBα和NF-κB p65表達(dá)的作用，抑制了TMZ的抗氧化應(yīng)激和緩解炎癥因子釋放的作用。以上結(jié)果提示TMZ通過Sirt1/PPARα，減弱p-IκBα和核p65的表達(dá)，減少ROS的生成，最終緩解巨噬細(xì)

22、胞的促炎應(yīng)答。
　　10.最后，我們收集了經(jīng)LPS，LPS+TMZ，LPS+TMZ+抑制劑（Sirt1抑制劑NAM，AMPK抑制劑Compound C和PPARα拮抗劑GW6471）處理過的巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基，干預(yù)心肌細(xì)胞，并用ELISA對(duì)巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基中的炎癥因子的檢測(cè)。同時(shí)用流式細(xì)胞術(shù)，檢測(cè)條件培養(yǎng)基處理的心肌細(xì)胞的凋亡水平。ELISA結(jié)果提示TMZ降低LPS導(dǎo)致的促炎細(xì)胞因子的釋放，而Sirt1，AMPK和PPARα的抑

23、制劑逆轉(zhuǎn)了TMZ降低促炎細(xì)胞因子釋放的作用。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示LPS處理的條件培養(yǎng)基可以顯著增加心肌細(xì)胞的凋亡，LPS+TMZ處理的條件培養(yǎng)基則細(xì)胞凋亡明顯降低，而TMZ的效應(yīng)可以被Sirt1抑制劑NAM，AMPK抑制劑Compound C和PPARα拮抗劑GW6471所阻斷。以上結(jié)果表明，TMZ通過影響Sirt1/AMPK和Sirt1/PPARα這些分子進(jìn)而影響炎癥因子的表達(dá)，最終緩解巨噬細(xì)胞所介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡作用。
　　結(jié)論