1、目的：
　　 自噬是真核細(xì)胞中的一種保守的代謝信號(hào)通路。目前已經(jīng)知道自噬與腫瘤、感染、免疫、心血管疾病等密切相關(guān)，但自噬的分子機(jī)制仍不清楚。繼續(xù)鑒定更多的自噬相關(guān)蛋白對(duì)于進(jìn)一步闡明自噬的分子機(jī)制具有重要意義。本課題前期實(shí)驗(yàn)通過(guò)雙向電泳結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜分析鑒定出了若干個(gè)細(xì)胞自噬前后表達(dá)量有差異的蛋白質(zhì)，其中發(fā)現(xiàn)果糖二磷酸醛縮酶A(Fructose-1，6-bisphosphateAldolase，ALDOA)、組氨酸三聚體核苷結(jié)合蛋白

2、2(Histidinetriadnucleotidebindingprotein2，HINT-2)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphateDehydrogenase，GAPDH)和ATP合成酶O亞基(ATPsynthasesubunitO，ATP5O)四種蛋白的量在HeLa細(xì)胞發(fā)生自噬后表達(dá)量明顯降低。因此本論文的主要目的是進(jìn)一步驗(yàn)證這四種蛋白在自噬前后的表達(dá)差異，并根據(jù)其差異結(jié)果選擇其中的線粒體蛋

3、白HINT-2，作為研究自噬的靶蛋白，初步探索其在自噬過(guò)程中的功能。
　　 方法：
　　 1．通過(guò)Real-timequantitativePCR驗(yàn)證ALDOA，HINT-2，GAPDH和ATP5O四個(gè)蛋白在饑餓前后mRNA水平的表達(dá)量的差異；
　　 2.3-MA處理細(xì)胞再行饑餓，Real-timequantitativePCR檢測(cè)四種候選蛋白mRNA水平的表達(dá)量；
　　 3．WesternBlot進(jìn)一步

4、驗(yàn)證HINT-2在不同自噬時(shí)相蛋白表達(dá)量的差異，初步選擇HINT-2作為進(jìn)一步研究的靶蛋白；
　　 4．克隆HINT-2基因，將其插入p3xFLAG-CMV-9質(zhì)粒，構(gòu)建真核表達(dá)載體p3xFLAG-HINT-2，并用酶切、菌落PCR及測(cè)序鑒定所構(gòu)建的重組載體；
　　 5．用羅氏FuGENEHD轉(zhuǎn)染試劑將質(zhì)粒p3xFLAG-HINT-2及其對(duì)照空載質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞內(nèi)，并以G418(1mg/ml)篩選穩(wěn)定表達(dá)FLA

5、G-HINT-2的細(xì)胞株FLAG-HINT-2-HeLa;
　　 6．以PCR檢測(cè)Neo基因，并以WesternBlot法檢測(cè)HINT-2蛋白表達(dá)水平，來(lái)驗(yàn)證篩選得到的過(guò)表達(dá)FLAG-HINT-2-HeLa細(xì)胞株；
　　 7．設(shè)計(jì)并合成三條HINT-2基因RNAi干擾片段，順轉(zhuǎn)至HeLa細(xì)胞，篩選沉默效果較好的片段，為后續(xù)構(gòu)建穩(wěn)定低表達(dá)細(xì)胞模型提供條件；
　　 8．為了給后續(xù)自噬相關(guān)的功能研究提供有利的細(xì)胞模型，

6、我們用前期工作中已經(jīng)構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒peGFP-LC3轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，并以G418篩選穩(wěn)定表達(dá)GFP-LC3的GFP-LC3-HeLa細(xì)胞株；
　　 9．采用所獲得的GFP-LC3-HeLa細(xì)胞株，以GFP標(biāo)簽的LC3表達(dá)變化情況作為指示，激光共聚焦下觀察不同濃度（200nM，500nM，1uM）雷帕霉素(Rapamycin)作用不同時(shí)間(1hr，2hr，3hr，4hr)，HeLa細(xì)胞內(nèi)熒光顆粒的亮度及大小，從而篩選雷帕霉素

7、誘導(dǎo)自噬的最適條件。
　　 10.為了獲得更多的自噬相關(guān)蛋白質(zhì)信息，采用饑餓法（以HBSS代替培養(yǎng)基）誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞產(chǎn)生自噬；用蔗糖梯度離心法粗提正常組與自噬組HeLa細(xì)胞線粒體蛋白；再通過(guò)雙向電泳(pH3-10，NL)分離自噬組與正常組線粒體蛋白質(zhì)，并用考馬斯亮藍(lán)染色；最后利用PDQuest軟件分析雙向圖譜，篩選出表達(dá)有差異蛋白點(diǎn)。
　　 結(jié)果：
　　 1．前期雙向電泳結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：ALDOA,H

8、INT-2GAPDH和ATP5O這四個(gè)候選蛋白在饑餓處理的HeLa細(xì)胞中表達(dá)量下降。為了進(jìn)一步驗(yàn)證前期實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，我們又設(shè)計(jì)了特異性引物，通過(guò)定量PCR檢測(cè)這四種蛋白mRNA水平的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)這四種蛋白的mRNA水平較未處理正常細(xì)胞明顯下降；而以自噬抑制劑3-MA處理過(guò)的細(xì)胞在同樣的饑餓條件下這幾個(gè)基因的mRNA水平則與對(duì)照無(wú)差異。
　　 2．WesternBlot與Real-timequantitativePCR對(duì)HINT-

9、2的驗(yàn)證結(jié)果表明：HINT-2的表達(dá)量在饑餓誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬時(shí)在mRNA水平與蛋白水平表達(dá)均下調(diào)。
　　 3．為進(jìn)一步研究自噬相關(guān)線粒體蛋白HINT-2的功能，我們構(gòu)建了真核表達(dá)載體p3xFLAG-HINT-2，經(jīng)菌落PCR、酶切及測(cè)序鑒定證實(shí)載體構(gòu)建成功。
　　 4．篩選了穩(wěn)定表達(dá)FLAG-HINT-2的FLAG-HINT-2-HeLa細(xì)胞株，為后續(xù)研究HINT-2過(guò)表達(dá)狀態(tài)下線粒體自噬打下了基礎(chǔ)。
　　 5．

10、篩選出兩條沉默效果較好的HINT-2基因RNAi干擾片段，將為后續(xù)構(gòu)建穩(wěn)定低表達(dá)細(xì)胞模型提供有利條件。
　　 6．獲得了穩(wěn)定表達(dá)自噬標(biāo)記蛋白GFP-LC3的GFP-LC3-HeLa細(xì)胞株，為自噬有關(guān)蛋白的功能研究提供了良好的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ图?xì)胞。
　　 7．以GFP-LC3-HeLa細(xì)胞為材料摸索了Rapamycin誘導(dǎo)自噬的最適條件，結(jié)果顯示200uM的Rapamycin作用2hr后，GFP-LC3-HeLa細(xì)胞中已出現(xiàn)明顯集

11、中的自噬泡，表明此條件下即可獲得明顯的自噬效果。
　　 8．在利用雙向電泳結(jié)合考馬斯亮藍(lán)染色進(jìn)一步篩選自噬相關(guān)候選蛋白的實(shí)驗(yàn)中，我們的結(jié)果顯示考馬斯亮藍(lán)染色得到的蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)少于銀染結(jié)果，但二者得到的蛋白質(zhì)點(diǎn)分布模式有些不同，因此提高蛋白上樣量應(yīng)當(dāng)可得到一些不同于銀染所得的差異自噬相關(guān)蛋白質(zhì)。
　　 結(jié)論：
　　 雙向電泳提示：饑餓誘導(dǎo)后的HeLa細(xì)胞內(nèi)四種候選蛋白表達(dá)量較正常對(duì)照組下調(diào)均超過(guò)50％，而Real-t

12、imequantitativePCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)四種候選自噬相關(guān)蛋白質(zhì)ALDOA,GAPDH，ATP5O和HINT-2饑餓后在mRNA水平上表達(dá)較對(duì)照下降30％左右，這說(shuō)明，這幾種蛋白在蛋白質(zhì)水平的變化至少部分是由于其轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生了變化而引起的。
　　 由于饑餓導(dǎo)致的能量缺乏是引起自噬的重要原因，而線粒體是細(xì)胞能量代謝的主要細(xì)胞器，因此我們選定線粒體蛋白HINT-2作為進(jìn)行進(jìn)一步研究自噬發(fā)生機(jī)制的靶向蛋白。為此我們構(gòu)建了真核表達(dá)載體

13、p3xFLAG-HINT-2，并轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞中，并以G418篩選出若干株穩(wěn)定表達(dá)的FLAG-HINT-2-HeLa細(xì)胞株。經(jīng)由Neo基因擴(kuò)增和WesternBlot驗(yàn)證，獲得了兩株穩(wěn)定過(guò)表達(dá)HINT-2的細(xì)胞。為了給自噬有關(guān)的機(jī)制研究提供有利的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，我們建立了穩(wěn)定表達(dá)自噬標(biāo)記蛋白LC3并攜帶GFP標(biāo)簽的GFP-LC3-HeLa細(xì)胞株，且采用這個(gè)細(xì)胞摸索了另一種自噬誘導(dǎo)方法Rapamycin誘導(dǎo)的適宜條件。這些實(shí)驗(yàn)為后續(xù)進(jìn)一步研