1、背景:桃紅四物湯為活血化瘀經典方劑，臨床上廣泛用于心腦血管疾病的治療，但其作用的分子機制仍不明確。本研究擬在證實桃紅四物湯對腦缺血損傷保護作用的基礎上，通過差異蛋白質組學與分子藥理學等實驗方法闡明其作用的分子機制。本課題獲得了重慶市衛(wèi)生局中醫(yī)藥科技項目(2012-2-87)的支持。
　　目的:驗證桃紅四物湯對腦缺血損傷的保護作用，尋找潛在蛋白靶標，表征關鍵的蛋白信號通路，闡明其作用的關鍵分子機制。為活血化瘀經典方的作用機制的深入闡

2、釋提供參考，并為其用于腦缺血的臨床防治提供新的理論依據。
　　方法:
　　1、桃紅四物湯對腦缺血損傷保護作用的驗證。在大鼠暫時性大腦中動脈阻塞(tMCAO)模型上，測定神經功能評分和腦梗塞體積，以考察桃紅四物湯對tMACO大鼠腦損傷的保護作用。采用氧糖剝奪-復氧(OGD-Reoxy)體外細胞模型，同時以CCK-8檢測細胞存活率，以考察桃紅四物湯對PC12細胞氧糖剝奪-復氧損傷的保護作用。
　　2、蛋白質組學技術鑒定桃紅

3、四物湯潛在的靶標蛋白。差異蛋白質組學方法分析桃紅四物湯作用的蛋白靶標采用二維凝膠電泳分離桃紅四物湯作用前后的PC12細胞蛋白，通過生物質譜鑒定差異表達蛋白;qPCR在mRNA水平驗證關鍵的靶標蛋白對差異蛋白進行分析，選擇關鍵的差異蛋白在mRNA水平進行進一步驗證;分析桃紅四物湯中各單味藥對代表性關鍵靶標蛋白的誘導作用針對代表性蛋白，采用免疫印跡法檢測目標蛋白的表達，以相同濃度(0.5mg·mL-1)單味中藥（桃仁、紅花、生地、當歸、川芎

4、、赤芍）提取物給藥處理24小時，分析單味藥的誘導活性。采用撤藥分析法，即依次從此復方中撤去一味中藥以相同濃度(1 mg·mL-1)提取物給藥處理24小時。再測定剩余藥味組成處方對HO-1的誘導作用，分析方中各藥味對整個復方誘導關鍵蛋白表達影響。
　　3、關鍵靶標蛋白通路在桃紅四物湯對氧糖剝奪-復氧損傷保護中的作用研究。在PC12細胞上，首先通過免疫蛋白印跡法研究桃紅四物湯對關鍵Ⅱ相蛋白酶HO-1表達的影響;再通過免疫蛋白印跡法與免

5、疫細胞熒光染色法對轉錄因子Nrf2核轉移進行研究，同時還采用免疫蛋白印跡法及相應的抑制劑對Nrf2上游的蛋白激酶的作用進行研究，以表征桃紅四物湯對Nrf2信號通路的作用;最后，通過采用PI3K特異性抑制劑抑制PI3K/Akt活性與采用誘騙寡核苷酸技術阻斷Nrf2的調控作用，在體外細胞模型上，以確證PI3K/Akt與Nrf2信號通路對桃紅四物湯保護作用的影響。
　　結果:
　　1、桃紅四物湯對腦缺血損傷的保護作用的研究。與假手

6、術組相比，tMCAO損傷模型組動物神經功能評分均值顯著降低，顯示造模成功。與模型組相比，桃紅四物湯提取物0.5 g·kg-1·day-1、1 g·kg-1·day-1、1.5g·kg-1·day-1組動物神經功能評分顯著升高。提示桃紅四物湯提取物對缺血再灌注引起的大鼠腦損傷具有保護作用。其中桃紅四物湯1.0g·kg-1·day-1組效果最優(yōu)。
　　與假手術組相比，tMCAO損傷模型組大鼠出現(xiàn)顯著腦梗死體積，顯示造模成功。與模型組相

7、比，桃紅四物湯提取物0.5 g·kg-1·day-1、1 g·kg-1·day-1、1.5g·kg-1·day-1組大鼠腦梗死體積顯著降低。提示桃紅四物湯提取物可減輕缺血-再灌注引起的腦損傷。其中桃紅四物湯中劑量組1.0g·kg-1·day-1組效果最優(yōu)。提示桃紅四物湯可顯著減輕tMCAO模型動物腦缺血損傷。
　　與正常對照組相比，0-2 mg·mL-1桃紅四物湯對PC12細胞處理24 h均不具有細胞毒性，提示可用于后續(xù)的保護作用

8、研究。與正常對照組相比，OGD-Reoxy模型組細胞活性顯著降低，顯示損傷造模成功。與模型組相比，桃紅四物湯0.5mg·mL-1、1 mg·mL-1、1.5mg·mL-1組細胞存活率均顯著升高。提示桃紅四物湯提取物對PC12細胞OGD-Reoxy損傷具有保護作用。
　　2、蛋白質組學技術鑒定桃紅四物湯潛在的靶標蛋白。差異蛋白質組學方法分析桃紅四物湯作用的蛋白靶標共26個差異表達蛋白點被成功鑒定。Gene Ontology(GO)分

9、析顯示這些蛋白參與多種生物過程具有不同分子功能。
　　Nrf2介導的Ⅱ相抗氧化酶為桃紅四物湯的主要靶標蛋白在26個被鑒定的蛋白中有6個屬于轉錄因子Nrf2介導的Ⅱ相蛋白酶。實時定量PCR驗證顯示0.5mg·mL-1、1 mg·mL-1、1.5mg·mL-1不同濃度桃紅四物湯在轉錄水平可誘導改變這些基因的表達。
　　桃紅四物湯單昧藥之間存在對HO-1的協(xié)同誘導效應。單味藥提取物的試驗結果顯示，川芎或赤芍對HO-1具有非常強的誘

10、導作用。紅花也顯著誘導HO-1表達。當歸具較弱的HO-1誘導作用，而其它組分沒有表現(xiàn)出可檢測的誘導HO-1表達作用。
　　撤藥分析法試驗結果顯示，桃紅四物湯全方顯著誘導HO-1的表達。撤去川芎或當歸后HO-1表達極顯著下降。撤去紅花或赤芍后HO-1表達也顯著降低。桃仁或生地單味藥實驗對HO-1沒有顯著誘導作用，而當分別從全方中撤去此兩味藥后，HO-1表達亦有所降低。四物湯與桃紅四物湯比較，表現(xiàn)出較弱的HO-1誘導作用。這些結果表明

11、，桃紅四物湯中川芎、當歸、紅花和赤芍是主要誘導HO-1表達的活性成分。然而，整個復方誘導HO-1表達的能力包含所有單味中藥的作用，處方藥味間可能存在協(xié)同效應。
　　3、桃紅四物湯對腦缺血損傷保護的關鍵分子機制驗證研究。在體外細胞模型上，桃紅四物湯能濃度依賴性（0.25 mg·ml-1、0.5 mg·ml-1和1.0mg·ml-1范圍內）與時間依賴性地（0-18h內）誘導HO-1表達，并可明顯促進Nrf2核轉移;0.5 mg·ml-

12、1與1.0 mg·ml-1桃紅四物湯均顯著地提高了PC12細胞OGD-Reoxy損傷下的存活率。在20μMLY294002預處理下，1.0 mg·ml-1桃紅四物湯的保護作用顯著降低，0.5 mg·ml-1桃紅四物湯的保護作用亦呈現(xiàn)降低趨勢，但沒有統(tǒng)計學意義。ARE誘騙ODNs能抑制Nrf2調控的Ⅱ相酶表達。在ARE誘騙ODNs預處理下，桃紅四物湯(1.0 mg·ml-1)的保護作用顯著降低，盡管ARE mut ODNs也一定程度上降低

13、了桃紅四物湯的保護作用，但是降低的程度明顯小于ARE誘騙ODNs的作用。結果顯示，LY294002與ARE誘騙ODNs顯著降低了桃紅四物湯對OGD-Reoxy損傷PC12細胞的保護，表明桃紅四物湯的保護作用可能由PI3K/Akt與Nrf2信號通路產生。
　　結論:
　　1.本研究在體內動物模型和體外細胞模型上，驗證了桃紅四物湯對腦缺血損傷的保護作用;
　　2.再采用差異蛋白質組學方法系統(tǒng)分離與鑒別定出了26個桃紅四物湯