1、鴨瘟(duck plague)又稱鴨病毒性腸炎(duck virus enteritis)，是鴨、鵝和其他雁形目禽類的一種急性、熱性、敗血性傳染病。本病發(fā)病快、死亡率高，是目前世界各國水禽業(yè)危害最嚴(yán)重的傳染病之一。該病的病原鴨瘟病毒(DuckPlague virus，DPV)是皰疹病毒科（Herpesvirales）、α皰疹病毒亞科（Alphaherpesvirinae）、馬立克氏病毒屬（Mardivirus）的成員之一。但由于DPV的

2、研究起步晚，其分子生物學(xué)研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于其它皰疹病毒。一段時(shí)間以來對于DPV的研究多集中于流行病學(xué)、診斷和防治等方面;與其分子生物學(xué)特性相關(guān)的基礎(chǔ)研究，如病毒的基因組結(jié)構(gòu)、物理圖譜、病毒基因功能以及病毒在機(jī)體細(xì)胞和組織中的復(fù)制及致病機(jī)理、病毒感染過程以及機(jī)體抗病毒感染機(jī)制等多方面研究均有許多不明之處。因此本論文的主要目的就是希望對本實(shí)驗(yàn)室測序獲得的鴨瘟病毒基因組序列進(jìn)行解析;并通過構(gòu)建一個(gè)可以對DPV進(jìn)行細(xì)菌遺傳學(xué)操作的平臺，為DPV的基

3、因功能研究提供技術(shù)手段的支持，此外利用該平臺用兩步RED重組敲除UL55基因，驗(yàn)證此平臺的可行性并初步闡釋UL55功能。主要研究內(nèi)容如下:
　　1、鴨瘟病毒中國強(qiáng)毒株基因組信息解析
　　對本實(shí)驗(yàn)室測序獲得的鴨瘟中國強(qiáng)毒株的基因組序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。鴨瘟病毒中國強(qiáng)毒株基因組組成為雙股線狀雙鏈DNA: UL-IRS-US-TRS，是典型的D型皰疹病毒基因組結(jié)構(gòu)。DPV CHv基因組全長162，175 bp，GC含量為44.8

4、9％，包括潛在的76個(gè)能編碼功能蛋白的ORF。BLAST搜尋相似性序列發(fā)現(xiàn)五條與DPV CHv同期或之后提交的其他鴨瘟病毒毒株全基因組序列，他們間具有高度同源性，進(jìn)化樹分析顯示六株DPV病毒按地域和毒力差異進(jìn)行分類，DPV CHv處于進(jìn)化樹的中間位置。對基因組編碼區(qū)的ORF進(jìn)行掃描分析發(fā)現(xiàn)，六株DPV在UL、US區(qū)域分別有23、5個(gè)ORF在核苷酸水平上存在整個(gè)ORF的缺失、部分序列插入、缺失等情況出現(xiàn)，這些突變的產(chǎn)生可能是造成六株不同來

5、源毒株毒力和地理差異的主要原因。而DPV基因組中不存在核苷酸序列插入或缺失的53個(gè)ORF在氨基酸水平上高度同源，多為DPV基因組的保守性基因，不受病毒傳代致弱及地域差異的影響，編碼蛋白大多為與病毒DNA代謝相關(guān)的結(jié)構(gòu)蛋白。密碼子使用模式分析結(jié)果顯示其在基因組密碼子的使用上偏向A/T結(jié)尾的密碼子，其密碼子使用模式主要受突變壓力的影響。將其與人類、大腸桿菌、酵母的密碼子使用模式進(jìn)行比較，結(jié)果表明鴨瘟病毒的密碼子使用模式與酵母系統(tǒng)更為接近。<

6、br>　　2、鴨瘟病毒UL55基因生物信息學(xué)分析
　　DPV UL55基因由561bp核苷酸組成，包括一個(gè)完整的開放性閱讀框，編碼一個(gè)由186個(gè)氨基酸組成的20.7981kDa蛋白質(zhì)。UL55蛋白沒有信號肽及跨膜區(qū)。密碼子分析顯示UL55基因偏向A/T結(jié)尾的密碼子，密碼子使用模式與人類最接近。UL55蛋白整體表現(xiàn)出親水性，抗原表位主要集中在相應(yīng)親水區(qū)域的無規(guī)則卷曲，其功能與病毒的裝配、出芽、成熟和釋放相關(guān)?；诤塑账嵝蛄械倪M(jìn)化樹分

7、析顯示DPV屬于馬立克氏病毒基因?qū)俚囊粏T。
　　3、鴨瘟病毒UL55基因的克隆、原核表達(dá)及多克隆抗體制備
　　通過將UL55基因通過克隆到表達(dá)載體pET32a(+)上實(shí)現(xiàn)對UL55蛋白的原核表達(dá)，試驗(yàn)表明重組UL55基因能在大腸桿菌BL21(DE)中進(jìn)行融合表達(dá)。通過優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件，UL55重組蛋白能在37℃條件下，通過0.8mM的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4h產(chǎn)生大量非可溶形式的包涵體蛋白。將包涵體蛋白通過裂解后進(jìn)行純化及復(fù)性處理

8、再與兔抗DPV CHv多克隆抗體進(jìn)行免疫印跡反應(yīng)，結(jié)果表明純化復(fù)性后的UL55蛋白具有與天然蛋白相似的免疫反應(yīng)活性。復(fù)性后的UL55蛋白免疫兔子制備的高免血清能夠與UL55重組蛋白發(fā)生良好的免疫反應(yīng)。
　　4、原核表達(dá)UL55蛋白作為抗原檢測DPV血清的間接ELISA方法的建立
　　本方法是基于純化的重組UL55原核表達(dá)蛋白建立的可以檢測DP血清的間接ELISA法，該方法特異性強(qiáng)，對抗鴨病毒性肝炎病毒(DHV)、鴨疫里默氏菌

9、(RA)、鴨大腸桿菌(E.coli)、鴨源沙門氏菌(Salmonella)、腫頭性出血癥病毒和鴨源流感病毒的陽性血清進(jìn)行檢測，結(jié)果均為陰性;該方法的對酶標(biāo)板內(nèi)或板間重復(fù)試驗(yàn)顯示變異系數(shù)均小于10％，能檢出經(jīng)1∶6400倍稀釋的DPV弱毒疫苗免疫鴨的陽性血清。將其與經(jīng)典的中和試驗(yàn)及DPV全病毒包被的ELISA同時(shí)檢測50份感染了DPV的臨床鴨血清樣本，發(fā)現(xiàn)其對DPV IgG的檢出率介于中和試驗(yàn)和DPV-ELISA之間。由于其制備方法簡便、

10、操作簡單，特異性、靈敏性較高。且不存在散毒的風(fēng)險(xiǎn)，具有良好的應(yīng)用前景，為進(jìn)一步組裝成試劑盒奠定了基礎(chǔ)。
　　5、鴨瘟病毒UL55基因轉(zhuǎn)錄、表達(dá)時(shí)相分析
　　以β-actin基因作為內(nèi)參基因，用相對熒光定量方法對UL55基因在體外感染宿主細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄情況進(jìn)行了分析。轉(zhuǎn)錄時(shí)相分析結(jié)果表明UL55基因在轉(zhuǎn)錄后的0-8h內(nèi)處于一個(gè)較低的水平;12h后開始迅速增加直至在感染后36h達(dá)到轉(zhuǎn)錄峰值，之后開始逐步下降，直到感染后的60h仍然

11、可以檢測到大量轉(zhuǎn)錄的UL55基因，UL55基因的轉(zhuǎn)錄過程可以被核酸抑制劑更昔洛韋抑制，說明UL55基因是嚴(yán)格依賴于DNA合成的γ2基因。Western-blot分析體外感染宿主細(xì)胞中UL55基因的表達(dá)時(shí)相表明UL55蛋白的表達(dá)水平也表現(xiàn)出相似的規(guī)律，進(jìn)一步佐證了UL55基因?yàn)棣?基因的結(jié)論。
　　6、細(xì)菌人工染色體重組鴨瘟病毒拯救系統(tǒng)平臺構(gòu)建
　　通過多步克隆構(gòu)建了含TK基因同源臂、報(bào)告基因EGFP和細(xì)菌人工染色體核心功能元

12、件的重組鴨瘟病毒轉(zhuǎn)移載體pUC18/EGFP-TKAB-BAC11，將其與DPV CHv病毒核酸共轉(zhuǎn)染獲得了重組病毒DPV CHv-BAC-G。利用EGFP報(bào)告基因的指示作用，通過8輪噬斑純化獲得了純化的重組病毒。提取環(huán)化時(shí)期的重組病毒DPV CHv-BAC-G，電擊轉(zhuǎn)化至DH10B細(xì)胞中，獲得了能夠在細(xì)菌中復(fù)制的重組病毒轉(zhuǎn)化子。將克隆化的病毒質(zhì)粒pBAC-DPV轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞DEF，成功拯救出重組病毒DPV CHv-BAC-G。拯救出

13、的重組病毒可以以細(xì)菌和病毒兩種形式存在，能夠?qū)崿F(xiàn)在細(xì)菌和宿主細(xì)胞內(nèi)的同時(shí)復(fù)制，有利于利用原核系統(tǒng)成熟的基因操作手段研究原本僅能在細(xì)胞水平研究的鴨瘟病毒，成功建立細(xì)菌人工染色體重組鴨瘟病毒拯救系統(tǒng)平臺。
　　7、重組鴨瘟病毒UL55基因缺失株的構(gòu)建及其體外生物學(xué)特性研究
　　在構(gòu)建的細(xì)菌人工染色體重組鴨瘟病毒拯救系統(tǒng)平臺基礎(chǔ)上，利用大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的兩步RED重組技術(shù)構(gòu)建UL55基因缺失株及其回復(fù)突變株。構(gòu)建的回復(fù)突變株克隆能夠

14、通過轉(zhuǎn)染DEF細(xì)胞獲得拯救產(chǎn)生與親本相同的致細(xì)胞病變，酶切圖譜與親本株DPV CHv-BAC-G無差異，是為真正的回復(fù)突變株?？瞻咴囼?yàn)、一步生長曲線和致病性比較結(jié)果表明，構(gòu)建的UL55缺失株和回復(fù)突變株與預(yù)期結(jié)果一致，能產(chǎn)生與親本株DPV CHv-BAC-G相似細(xì)胞病變效應(yīng)、形成形態(tài)及大小相似的空斑、在感染細(xì)胞中展現(xiàn)出相同的增殖周期。
　　8、DPV UL55基因在感染宿主細(xì)胞體內(nèi)的定位分析
　　以制備的兔抗UL55多克隆抗

15、體作為一抗，用間接免疫熒光的方法檢測UL55基因編碼蛋白在感染細(xì)胞內(nèi)的動態(tài)分布。結(jié)果顯示，UL55蛋白最早在感染后的5.5h內(nèi)開始在細(xì)胞質(zhì)大量表達(dá)，并隨著時(shí)間的推移表達(dá)量逐漸增多，其表達(dá)量在感染后的22.5h達(dá)到峰值。之后UL55蛋白的表達(dá)量逐步下降，并從細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的散在分布顆粒逐漸形成熒光斑向核膜周邊轉(zhuǎn)移，大量存在于核膜兩極。之后隨著時(shí)間的推移，UL55蛋白的熒光逐漸消失，推測其隨著病毒復(fù)制周期的結(jié)束和細(xì)胞的崩解而消失。
　　9、