1、蛋白質(zhì)組學(xué)的研究是集分析化學(xué)、分子生物學(xué)、生物信息學(xué)等相關(guān)學(xué)科研究領(lǐng)域中的熱門、前沿課題。本論文利用目前較為先進(jìn)的CPLL、蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，建立了CPLL應(yīng)用于比較蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法。開(kāi)展了雞蛋蛋清中低豐度蛋白質(zhì)組在孵化過(guò)程中的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究。利用肽配體庫(kù)技術(shù)、二維電泳技術(shù)、LTQ質(zhì)譜檢測(cè)、MALDI-TOF二級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)等技術(shù)，考察了雞蛋蛋清低豐度蛋白質(zhì)組的變化特征。對(duì)雞胚蛋孵化前期、胚胎快速發(fā)育期的蛋清蛋白質(zhì)組、差異低豐度蛋白質(zhì)

2、的生物學(xué)功能進(jìn)行了相關(guān)研究，主要內(nèi)容摘要如下:
　　利用低豐度蛋白質(zhì)研究中的最新技術(shù)方法，肽配體庫(kù)技術(shù)（Combinatorial peptide ligand libraries，CPLL）研究比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的適用性，并對(duì)該方法適用于蛋清低豐度蛋白質(zhì)富集過(guò)程進(jìn)行方法優(yōu)化。通過(guò)考察pH7.4和pH8.8，PBS和非PBS緩沖體系、HOS和ureaCHAPS不同洗脫順序下，肽配體庫(kù)對(duì)蛋清低豐度蛋白質(zhì)豐度均衡化的影響。利用肽配體

3、較高效的富集蛋清低豐度蛋白質(zhì)的使用條件為非PBS緩沖體系，ureaCHAPS直接洗脫。分離溶菌酶條帶的條件為:先HOS后ureaCHAPS洗脫順序。利用CPLL-LTQ線性四級(jí)桿離子阱檢測(cè)技術(shù)，對(duì)5個(gè)差異條帶進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)能夠檢測(cè)到47種蛋清蛋白質(zhì)。該研究突破CPLL目前利用的局限性，有望將低豐度蛋白質(zhì)種類特征作為雞蛋品質(zhì)檢測(cè)的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)之一。利用檢測(cè)蛋清中特征低豐度蛋白質(zhì)識(shí)別有關(guān)蛋品的應(yīng)用思路。
　　利用二維電泳技術(shù)，探明蛋清中低豐

4、度蛋白質(zhì)組二維電泳譜圖譜信息數(shù)據(jù)庫(kù)。建立了蛋清中低豐度蛋白質(zhì)組在二維電泳譜圖上的分子量、等電點(diǎn)坐標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)。將蛋清蛋白質(zhì)pH4-7、0-170KDa二維電泳圖譜劃分為17個(gè)具有代表性的質(zhì)譜鑒定區(qū)。將新鮮蛋清各個(gè)區(qū)域檢測(cè)蛋白質(zhì)，建立數(shù)據(jù)、蛋清蛋白點(diǎn)坐標(biāo)數(shù)據(jù)、各個(gè)蛋白點(diǎn)坐標(biāo)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)信息，為雞蛋蛋清蛋白質(zhì)組的研究提供了數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)。該數(shù)據(jù)庫(kù)為以蛋清蛋白質(zhì)組學(xué)、比較蛋清蛋白質(zhì)組學(xué)研究為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)研究，提供參考基準(zhǔn)。
　　利用CPLL、二維電

5、泳、基質(zhì)輔助激光解吸-飛行時(shí)間二級(jí)質(zhì)譜(Matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight，MALDI-TOF)研究孵化早期蛋清低豐度蛋白質(zhì)組變化?？疾炝耸芫u蛋早期孵化過(guò)程，伴隨胚胎發(fā)育，蛋清蛋白的溶液特征。利用CPLL觀察到的蛋清蛋白質(zhì)組的變化特點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)孵化早期，ovoinhibitor卵抑制劑蛋白前體、雞簇蛋白的前體、載脂蛋白D前體、和細(xì)胞外脂肪酸結(jié)合蛋白前體，

6、相對(duì)豐度值含量顯著增加(P＜0.01orp＜0.05)。同時(shí)，雞簇蛋白的前體，在兩個(gè)區(qū)域，一個(gè)范圍為較大的分子量范圍，另一個(gè)高pH值的范圍。此外，卵清蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白，位于高pH區(qū)域的新坐標(biāo)。針對(duì)這些發(fā)現(xiàn)，對(duì)這一階段中低豐度蛋白質(zhì)的功能進(jìn)行推測(cè)，對(duì)這些低豐度蛋白質(zhì)可能參與的生物反應(yīng)進(jìn)行分析。
　　基于上述研究，針對(duì)胚胎發(fā)育過(guò)程中蛋清存留的最后一天，即孵化16d進(jìn)行蛋清蛋白質(zhì)組學(xué)特征研究。擴(kuò)大二維電泳圖的觀測(cè)范圍，研究并分析蛋清蛋白

7、質(zhì)在被胚胎全部吞食完畢的過(guò)程中，蛋白質(zhì)組經(jīng)過(guò)肽配體富集前后變化。研究發(fā)現(xiàn)，胚胎大量吞食蛋白質(zhì)的過(guò)程中，蛋清蛋白質(zhì)并非簡(jiǎn)單營(yíng)養(yǎng)及能量的供給者。隨著胚胎的生長(zhǎng)，蛋白質(zhì)含量逐天下降，蛋清蛋白質(zhì)的種類則逐天增多。相對(duì)豐度上升的蛋白點(diǎn)涉及SerpinFamily;Clusterin Family;Transferr in Family和bacterial permeability-increasing protein(BPI)family;Lys

8、ozymefamily5個(gè)蛋白質(zhì)家族。相對(duì)豐度值顯著性下降的點(diǎn)涉及SerpinFamily，TransferrinFamily和bacterialpermeability-increasingprotein(BPI)family3個(gè)蛋白質(zhì)家族。
　　開(kāi)展了胚胎快速增長(zhǎng)階段，蛋清蛋白質(zhì)組的變化規(guī)律的研究。利用CPLL、2-DE、MALDI-TOFMS/MS技術(shù)針對(duì)孵化過(guò)程中蛋清蛋白質(zhì)組的變化研究中發(fā)現(xiàn):相對(duì)于孵化7d，蛋清蛋白質(zhì)組中

9、有88個(gè)蛋白點(diǎn)經(jīng)過(guò)肽配體庫(kù)富集后得到檢測(cè)，并表現(xiàn)出與7d同樣處理方式下，相對(duì)豐度值顯著性增多的變化狀態(tài)。16個(gè)蛋白點(diǎn)只出現(xiàn)在蛋清蛋白質(zhì)被完全吸收后的最后1d的二維電泳譜圖中，且未在其他對(duì)照試驗(yàn)組中發(fā)現(xiàn)。對(duì)三個(gè)蛋白質(zhì)家族:uPAR/Ly-6超家族，組氨酸磷酸酶家族和OLFML3中的5個(gè)蛋白質(zhì)的分析和研究發(fā)現(xiàn)，這些蛋白很可能參與胚胎神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，并發(fā)揮其生物學(xué)功能。該研究還說(shuō)明，蛋清蛋白質(zhì)在保護(hù)受精雞蛋胚胎發(fā)育的過(guò)程中，不僅為雞胚個(gè)體成熟提

10、供營(yíng)養(yǎng)，其功能性包括保護(hù)胚胎微環(huán)境，蛋清蛋白質(zhì)似乎以系統(tǒng)性統(tǒng)籌調(diào)節(jié)的方式，穩(wěn)定雞蛋內(nèi)部，使雞胚個(gè)體最大程度實(shí)現(xiàn)成活可能性等。
　　最后，利用比較二維電泳ImageMaster、V7.0操作環(huán)境、NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)、GO分析、KEGG通路分析數(shù)據(jù)庫(kù)，比較孵化過(guò)程中各階段蛋清蛋白質(zhì)組的變化規(guī)律。發(fā)生變化蛋清中低豐度蛋白質(zhì)的分子功能主要分為6種，分布在細(xì)胞質(zhì)13個(gè)位置區(qū)域內(nèi)。變化的蛋清蛋白質(zhì)的功能性覆蓋:離子結(jié)合蛋白，脂質(zhì)結(jié)合蛋白，酶調(diào)節(jié)活