1、目的:合成并優(yōu)化制備多肽殼聚糖,制備多肽殼聚糖阿霉素納米粒,進(jìn)行質(zhì)量評價(jià),考察體外釋放度。并研究其細(xì)胞攝取機(jī)制及影響因素,考察納米粒的體內(nèi)外靶向性
　　方法:1、通過兩步反應(yīng)合成多肽殼聚糖,第一步以谷胱甘肽為原料,通過酰胺化反應(yīng)合成中間產(chǎn)物巰基殼聚糖,第二步通過多肽末端巰基與巰基殼聚糖末端巰基進(jìn)行二硫鍵反應(yīng)將多肽偶聯(lián)于殼聚糖上。紅外光譜、核磁光譜對產(chǎn)物進(jìn)行表征,熒光分光光度法測定多肽的偶聯(lián)率。并改變各產(chǎn)物投藥比對多肽殼聚糖的合成進(jìn)

2、行優(yōu)化。
　　2、通過離子交聯(lián)法合成多肽殼聚糖阿霉素納米粒,并通過包封、粒徑、zeta電位,透射電鏡對納米粒進(jìn)行表征。MTT法檢測空白載體的細(xì)胞毒性。透析法考察不同pH條件下多肽殼聚糖阿霉素納米粒的體外釋藥情況,并于各時(shí)間取樣,高效液相色譜法檢測各組藥物濃度,計(jì)算各組累計(jì)釋放度。
　　3、納米粒細(xì)胞攝取因素的考察。選取EGFR高表達(dá)的A431細(xì)胞及受體低表達(dá)的HepG2細(xì)胞,分別給予多肽殼聚糖阿霉素納米粒(GE11-DOX-

3、NP)、殼聚糖阿霉素納米粒(DOX-NP)及阿霉素溶液?？疾鞎r(shí)間、濃度、能量因素對細(xì)胞攝取的影響。并通過高效液相色譜檢測細(xì)胞內(nèi)藥物含量,BCA蛋白試劑盒檢測細(xì)胞蛋白濃度,胞內(nèi)藥物含量以每毫克蛋白含阿霉素藥量表示。
　　4、納米粒細(xì)胞攝取途徑的考察。將FITC標(biāo)記于多肽殼聚糖納米粒上,并篩選無毒劑量的各類抑制劑濃度,選取A431、HepG2細(xì)胞,在抑制劑阻斷通路的情況下,加入熒光標(biāo)記的多肽殼聚糖納米粒,以未加任何抑制劑處理的細(xì)胞作為

4、對照,通過流式細(xì)胞儀檢測各組抑制劑的抑制效率,激光共聚焦觀察納米粒的胞內(nèi)分布及抑制后納米粒的攝取情況。
　　5、多肽殼聚糖阿霉素納米粒的體外靶向考察,選取A431、HepG2細(xì)胞,分別給予不同濃度的GE11-DOX-NP、DOX-NP、阿霉素溶液,MTT法檢測上述三種制劑對腫瘤細(xì)胞的生長抑制作用。建立A431的腫瘤球模型,分別給予上述三種制劑,以未處理的腫瘤球做為對照組。每兩天給藥一次,并測定腫瘤球的長短徑,共給藥6天,考察給藥過

5、程中上述三種制劑對于腫瘤球的抑制情況。建立A431的腫瘤球模型,給予GE11-DOX-NP、DOX-NP,激光共聚焦觀察腫瘤球?qū){米粒的攝取情況。
　　6、多肽殼聚糖阿霉素納米粒的體內(nèi)靶向考察,建立小鼠s180腫瘤模型,隨機(jī)分為4組, GE11-DOX-NP組、DOX-NP組、阿霉素溶液組,各組給藥劑量都相當(dāng)含有阿霉素5 mg/kg,空白對照組生理鹽水組,每兩日一次,共持續(xù)7天。鼠重隔天稱一次,并測量瘤體的大小,實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,測定腫

6、瘤的質(zhì)量,計(jì)算各組的抑瘤率。
　　結(jié)果:1、優(yōu)化合成多肽殼聚糖的制備方法,通過產(chǎn)物的紅外圖譜與核磁圖譜可發(fā)現(xiàn),產(chǎn)物具有多肽結(jié)構(gòu)中的特征峰,證明多肽已經(jīng)連接在了殼聚糖上。通過熒光分光光度法測定優(yōu)化后的多肽的偶聯(lián)數(shù)為10.05±0.11μg/mg。
　　2、合成多肽殼聚糖阿霉素納米粒,所得處方包封率為(28.5±1.06％),粒徑約400nm,zeta電位約為+34mv,阿霉素納米粒所得的處方包封率為(29.23±2.06％),

7、粒徑約為390nm,zeta電位約為+31mv。多肽殼聚糖納米粒載體在500μg/mL濃度下沒有細(xì)胞毒性,納米粒體外釋放結(jié)果顯示,納米粒隨著pH的降低,釋放度越高。
　　3、影響納米粒細(xì)胞攝取因素考察。經(jīng)考察多肽殼聚糖阿霉素納米粒在細(xì)胞攝取過程中對時(shí)間、濃度與能量均呈依賴性。隨著給藥時(shí)間的延長,細(xì)胞攝取的藥物增加,但在4h后細(xì)胞內(nèi)藥物有降低的趨勢。隨著給藥濃度的增高,細(xì)胞對藥物的攝取量也隨之升高。在低溫/低能量條件下,細(xì)胞對藥物的

8、攝取量也低。
　　4、納米粒攝取途徑的考察。經(jīng)抑制劑干預(yù)、流式細(xì)胞法檢測表明多肽納米粒的細(xì)胞攝取途徑與細(xì)胞的類型有關(guān)。在A431細(xì)胞中,加入網(wǎng)格蛋白通道阻斷劑后,納米粒的細(xì)胞攝取量抑制率約為54％,其在A431細(xì)胞的細(xì)胞攝取途徑中經(jīng)由網(wǎng)格蛋白內(nèi)化,競爭抑制劑GE11肽對納米粒的細(xì)胞攝取也有一定的抑制作用,說明其在A431細(xì)胞的細(xì)胞攝取途徑中經(jīng)由網(wǎng)格蛋白內(nèi)化,且可由EGFR受體介導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞。而對于HepG2細(xì)胞,網(wǎng)格蛋白通道抑制劑及

9、巨胞飲通道抑制劑可明顯抑制納米粒的細(xì)胞攝入。說明在HepG2細(xì)胞中納米粒的細(xì)胞攝取通過網(wǎng)格蛋白與巨胞飲兩種途徑協(xié)同介導(dǎo)的。激光共聚焦觀察納米粒細(xì)胞攝取后主要集中于溶酶體內(nèi)。
　　5、體外靶向考察。對于A431,GE11-DOX-NP組較DOX-NP組、溶液組具有很好的細(xì)胞抑制作用。在腫瘤球抑制方面,GE11-DOX-NP組、DOX-NP組、溶液組在最終的第6天腫瘤球的體積是最初體積的0.57、0.74、0.50倍。激光共聚焦觀察G

10、E11-DOX-NP組較被動組能更好的滲透進(jìn)腫瘤球內(nèi)部并具有更高的熒光強(qiáng)度,表明GE11-DOX-NP組在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中具有較好的靶向性。
　　6、體內(nèi)靶向考察。給藥治療后,阿霉素溶液組隨著給藥的進(jìn)行體重明顯的降低。而其他各實(shí)驗(yàn)組的小鼠的體重均呈現(xiàn)了不同程度的增加。通過抑瘤率可知,GE11-DOX-NP組、DOX-NP組、溶液組的抑瘤率分別為(50.39±20.22％)、(44.15±20.05％)、(75.39±7.21％)?？?/p>

11、知GE11-DOX-NP比DOX-NP可以較好的靶向治療EGFR高表達(dá)的腫瘤,比溶液組能更好的降低藥物的毒副作用。
　　結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)制備了的多肽殼聚糖阿霉素納米粒具有在低pH條件下釋放更完全的體外釋放特性,納米粒的細(xì)胞攝取與時(shí)間、濃度成正相關(guān),受能量影響明顯。納米粒對細(xì)胞攝取機(jī)制研究表明在A431細(xì)胞中納米粒主要經(jīng)由網(wǎng)格蛋白介導(dǎo),并可由EGFR受體介導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞。而對于HepG2細(xì)胞,其主要是經(jīng)由網(wǎng)格蛋白與巨胞飲途徑共同作用內(nèi)化的。