1、細胞色素P450 BM-3(CYP102A)是一種單加氧酶，具有脂肪酸羥基化活性。野生型P450 BM-3酶能催化長鏈飽和或不飽和脂肪酸。經過蛋白質改造，P450BM-3酶催化底物的范圍擴展至烷烴、環(huán)烷烴等，其中P450 BM-3(A74G/F87V/L188Q)可以催化吲哚進行羥基化反應。本研究為了改善P450 BM-3酶的催化活性和熱穩(wěn)定性，并擴展酶的底物譜，采用半理性設計方法，對P450 BM-3進行了蛋白質工程改造，得到了多個催

2、化性能得到改善的突變酶，并對突變酶的結構與功能關系進行了分析。
　　首先，以P450 BM-3(A74G/F87V/L188Q/D422G)為親本，利用B-FITFER分析方法對P450 BM-3的458個氨基酸進行b-factor值測定，篩選對熱穩(wěn)定性最可能產生影響的位點，并結合蛋白質的三維結構將位點控制在底物通道入口最終確定突變位點，而后對該位點進行定點飽和突變，從而進一步篩選出催化活力或熱穩(wěn)定性得到提高的突變酶P450 BM

3、-3(A74G/F87V/L188Q/D422G/G46S)（以下簡稱為突變酶G46S）。對突變酶的基本酶學性質進行研究發(fā)現(xiàn)，該突變酶的半失活溫度(T5010)比親本酶提高了5℃（達到48℃）;在50℃的半衰期t1/2比親本酶延長了一倍;突變酶Km降低了22％，kca,提高了90％，催化效率kcat/Km(67.42min-1·mM-1)比親本提高了1.48倍。
　　第二，以P450-BM-3(A74G/F87V/L188Q)為親

4、本，對46位點進行了定點飽和突變，以進一步考察該位點對于對P450 BM-3催化功能的影響性質。結果發(fā)現(xiàn)，從46位殘基的定點飽和突變文庫中篩選得到了6個催化吲哚形成靛藍活力得到提高的突變酶P450 BM-3(A74G/F87V/L188Q/G46N)(以下簡稱為G46N突變酶，N指代不同的氨基酸): G46Y、G46E、G46W、G46R、G46V和G46S突變酶(其中G46S突變酶區(qū)別于第一部分的突變酶G46S)。其中，催化效率提高最

5、多的是G46W突變酶，其催化效率接近于親本酶的7.03倍。同時發(fā)現(xiàn)，G46E、G46Y和G46W突變酶不僅催化吲哚羥基化能力提高，其熱穩(wěn)定性也得到了提高。
　　第三，為了拓展P450 BM-3的催化專一性、得到可以催化甾醇類底物羥基化反應的突變酶，對P450 BM-3進行了進一步的半理性改造。利用hotspot軟件分析可能影響酶專一性改變的位點，然后通過Swiss-model在線模擬蛋白質的三維結構構建序列突變酶，篩選出對于底物通

6、道入口結構有所改變的突變方式，最終得到以P450 BM-3(A74G/F87V/L188Q)為親本，蛋白質的N端截斷20個氨基酸的突變酶（以下簡稱為-20突變酶），然后通過定點突變構建了真實的-20突變酶，進并對其催化甾醇類物質羥基化反應的性質進行了考察。雖然最終沒有獲得可以催化甾醇類物質羥基化的P450 BM-3突變酶，但為采用分子設計手段構建可催化甾醇底物的P450 BM-3工程酶進行了有益的嘗試。
　　本研究應用半理性分子設