1、目的：
　　本課題旨在制備PLGA、CS納米粒(nPLGA、nCS)并研究nPLGA、nCS和nAg對(duì)牙周膜細(xì)胞毒性、增殖與礦化的影響及抗菌特性。為后期用于牙周組織修復(fù)與再生的納米復(fù)合支架的制備和生物學(xué)性能的研究及臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　第一章 nPLGA、nCS的制備及物理學(xué)特征
　　1.nPLGA的制備:采用乳化溶劑揮發(fā)法[30]制備nPLGA:將100mgPLGA溶于10ml丙酮中，室溫下磁力攪

2、拌800rpm/min至完全溶解后緩慢倒入40ml2％聚乙烯醇溶液中，并繼續(xù)磁力攪拌8h;待溶劑完全揮發(fā)后（溶液呈淡藍(lán)色），15，000rpm/min離心15min，去上清，沉淀部分用去離子水清洗三次并重懸后，超聲混勻處理20s，自然風(fēng)干備用。
　　2.nCS的制備:用離子交聯(lián)法[31]制備nCS:將20mgCS溶于20ml1％的冰醋酸溶液中，室溫下磁力攪拌至完全溶解后，用10M-NaOH調(diào)節(jié)PH至4.6-6.0，然后再在磁力攪拌

3、下將5ml濃度為1mg/ml的多聚磷酸鈉溶液，逐滴滴入殼聚糖溶液中（約15s/滴），待溶液呈淡藍(lán)色時(shí)，15，000rpm/min離心15 min，去上清，沉淀部分用去離子水清洗三次并重懸后，超聲混勻處理20s，自然風(fēng)干備用。
　　3.特征:分別取nPLGA、nCS懸液適量，用Malvern Zetasizer3000HS儀分別測(cè)定納米粒的粒徑及表面電位;分別將適量nPLGA、nCS懸液滴于銅網(wǎng)上，靜置2min后用鑷子夾起銅網(wǎng)，并用

4、濾紙吸去多余液體;室溫下干燥后，置于透射電鏡下觀察并進(jìn)行拍照。
　　第二章 nPLGA、nCS和nAg的生物學(xué)特性
　　1.人牙周膜細(xì)胞的培養(yǎng):取12-24周歲志愿者（知情同意）因正畸或阻生拔除的無齲、無牙周炎的正畸牙或阻生牙，刮取牙周膜組織，沖洗、剪碎、消化，改良組織塊酶消化法培養(yǎng)，待細(xì)胞飽和達(dá)80％時(shí)，按1∶2-3的比例傳代培養(yǎng)，3-5代人牙周膜細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。
　　2.細(xì)胞毒性與增殖:實(shí)驗(yàn)分為3大組:nPLGA組、

5、nCS組和nAg組;nPLGA組包括空白對(duì)照組、1mg/mlPLGA粉末組、0.5mg/ml nPLGA組、1mg/ml nPLGA組和2mg/ml nPLGA組5個(gè)亞組;nCS組分為空白對(duì)照組、1mg/ml CS粉末組、0.5mg/ml nCS組、1mg/ml nCS組和2mg/ml nCS組5個(gè)亞組;nAg組分為2μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml和50μg/ml5個(gè)亞組。以1-5×103個(gè)/

6、孔濃度接種96孔板，24h、48h和72h檢測(cè)牙周膜細(xì)胞的毒性，1d、2d、3d、5d和7d檢測(cè)牙周膜細(xì)胞的增殖。
　　3.茜素紅染色:經(jīng)nPLGA、nCS處理的牙周膜細(xì)胞成骨誘導(dǎo)21day，茜素紅染色后倒置顯微鏡下觀察礦化結(jié)節(jié)的形成。
　　4.qRT-PCR實(shí)驗(yàn):牙周膜細(xì)胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)21day后，qRT-PCR測(cè)試牙周膜細(xì)胞成骨相關(guān)基因（OCN、ALP和OPN）的表達(dá)。
　　5.抑菌實(shí)驗(yàn):采用平板菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)nPL

7、GA、nCS和nAg對(duì)大腸桿菌的抑菌作用。
　　第三章 nPLGA、nCS與nAg混合物的制備及生物學(xué)特性初步鑒定
　　實(shí)驗(yàn)一 nPLGA、nCS混合物的生物學(xué)特性初步鑒定
　　1.細(xì)胞毒性與增殖:nPLGA與nCS以9∶1、8∶2、7∶3的比例與牙周膜細(xì)胞混合培養(yǎng)，于24h、48h和72h檢測(cè)牙周膜細(xì)胞的毒性，1d、2d、3d、5d和7d檢測(cè)牙周膜細(xì)胞的增殖。
　　2.茜素紅染色:牙周膜細(xì)胞成骨誘導(dǎo)21day，

8、茜素紅染色后倒置顯微鏡下觀察礦化結(jié)節(jié)的形成。
　　3.qRT-PCR實(shí)驗(yàn):牙周膜細(xì)胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)21day后，qRT-PCR測(cè)試牙周膜細(xì)胞成骨相關(guān)基因（OCN、ALP和OPN）的表達(dá)。
　　實(shí)驗(yàn)二 nPLGA、nCS與nAg混合物的生物學(xué)特性初步鑒定
　　1.細(xì)胞毒性與增殖:根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)選擇合適比例的nPLGA和nCS以及適當(dāng)濃度的nAg，實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、nPLGA/nCS/nAg組和PLGA/CS/nAg組，于24

9、h、48h和72h檢測(cè)牙周膜細(xì)胞的毒性，1d、2d、3d、5d和7d檢測(cè)牙周膜細(xì)胞的增殖。
　　2.茜素紅染色:牙周膜細(xì)胞成骨誘導(dǎo)21day，茜素紅染色后倒置顯微鏡下觀察礦化結(jié)節(jié)的形成。
　　3.qRT-PCR實(shí)驗(yàn):牙周膜細(xì)胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)21day后，qRT-PCR測(cè)試牙周膜細(xì)胞成骨相關(guān)基因(OCN、ALP和OPN)的表達(dá)。
　　4.nPLGA/nCS/nAg混合物的抑菌性:nPLGA、nCS和nAg抑菌濃度均設(shè)為800

10、μg/ml，實(shí)驗(yàn)分為nPLGA、nCS、nAg、nPLGA/nCS、nPLGA/nAg、 nCS/nAg和nPLGA/nCS/nAg組。
　　結(jié)果：
　　1.成功制備nPLGA和nCS
　　透射電鏡觀察顯示:nPLGA呈球形，nCS形態(tài)類似球形，納米粒大小較均勻，形態(tài)規(guī)則，邊緣清晰。
　　2.nPLGA、nCS和nAg的生物學(xué)特性
　　nPLGA、nCS和nAg對(duì)人牙周膜細(xì)胞的相對(duì)增殖率均在80％以上，根據(jù)

11、ISO10993-5，可以認(rèn)為nPLGA、nCS和nAg對(duì)人牙周膜細(xì)胞無毒性。nPLGA、nCS和PLGA、CS粉末一樣對(duì)人牙周膜細(xì)胞的增殖無影響，且各組均與空白對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05）。nAg當(dāng)濃度小于40μg/ml，對(duì)人牙周膜細(xì)胞的增殖無影響(p＜0.05）;但當(dāng)濃度不小于40μg/ml時(shí)，在第5d細(xì)胞的OD值低于空白對(duì)照組，且與空白對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05）。
　　nPLGA和PLGA粉末對(duì)大腸桿菌無抑菌作

12、用。nCS和CS對(duì)大腸桿菌的抑菌作用隨著濃度的增加逐漸增加。對(duì)于nCS組，0.8mg/ml組抑菌率低于2mg/ml和5mg/ml組的抑茵率，并且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05），其余各濃度組間無差異(p＞0.05)。對(duì)于CS粉末組，各濃度組與5mg/ml濃度組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05），其余各組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05）。相同濃度的nCS的抑菌率比CS粉末的抑菌率高，且當(dāng)濃度不大于2mg/ml時(shí)，nCS的抑菌率明顯高于CS粉末組，

13、兩組間的抑菌率具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05）。
　　3.nPLGA、nCS和nAg混合物的制備和生物學(xué)特性
　　nPLGA和nCS混合物對(duì)牙周膜細(xì)胞的相對(duì)增殖率均在95％以上，根據(jù)ISO10993-5 nPLGA和nCS混合物對(duì)牙周膜細(xì)胞無毒性。經(jīng)nPLGA和nCS混合物處理的牙周膜細(xì)胞的OD值隨時(shí)間的增加也不斷增加，且與空白組無明顯差異(p＞0.05)。
　　nPLGA/nCS/nAg和PLGA/CS/nAg對(duì)牙周膜

14、細(xì)胞的相對(duì)增殖率均在95％以上，根據(jù)ISO10993-5 nPLGA/nCS/nAg和PLGA/CS/nAg對(duì)牙周膜細(xì)胞無毒性。細(xì)胞的OD值隨時(shí)間的增加不斷增加，組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。
　　nPLGA/nCS/nAg組和PLGA/CS/nAg組茜素紅染色顏色較空白組較深，且礦化結(jié)節(jié)也較空白組明顯，兩者間顏色和礦化結(jié)節(jié)無明顯差異。nPLGA/nCS/nAg組和PLGA/CS/nAg組OCN、OPN的表達(dá)明顯高于空白組，且

15、與空白組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05);兩者間未發(fā)現(xiàn)有差異;ALP的表達(dá)PLGA/CS/nAg組稍高于空白組，但未發(fā)現(xiàn)組間有差異;nPLGA/nCS/nAg組和PLGA/CS/nAg組間OCN、ALP、OPN的表達(dá)未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　nPLGA對(duì)nCS和nAg的抑菌性無影響，且當(dāng)nCS和nAg的濃度為0.8mg/ml時(shí)，未發(fā)現(xiàn)兩者對(duì)彼此的抑菌性有影響。
　　結(jié)論：
　　1.成功制備nPLGA、nCS，納米粒大小較均

16、勻，形態(tài)規(guī)則，邊緣清晰。
　　2.nPLGA、nCS和PLGA、CS粉末一樣，擁有較好的生物相容性，對(duì)人牙周膜細(xì)胞無毒性且不影響人牙周膜細(xì)胞的增殖。當(dāng)nAg濃度不大于50μg/ml時(shí)，對(duì)人牙周膜細(xì)胞無毒性，但濃度大于等于40μg/ml，會(huì)對(duì)人牙周膜細(xì)胞的生長產(chǎn)生抑制作用。nPLGA/nCS/nAg和PLGA/CS/nAg對(duì)牙周膜細(xì)胞無毒性，對(duì)牙周膜細(xì)胞的增殖無影響。
　　3.nCS和CS對(duì)大腸桿菌均有較強(qiáng)的抑菌效果，但濃度低