1、為建立一套兔轉基因克隆的技術體系,本研究對核移植重構胚的激活方法及體細胞和重構胚的重編程的處理方法進行了研究。
　　 1、對轉基因重構胚的激活方法進行了模索。將電融合后的重構胚隨機分成三組,分別在M199培養(yǎng)液中培養(yǎng)0.5h、1.5h和2.5h后再進行化學激活,探討融合-激活間隔時間對轉基因克隆重構胚發(fā)育的影響,結果發(fā)現(xiàn):隨著融合-激活間隔時間的延長,重構胚的分裂率與囊胚率也逐漸增加,當間隔時間延長至2.5h時,重構胚的分裂率與

2、囊胚率顯著高于0.5h組(78.08％vs63.16％,31.51％vs17.11％,P＜0.05);將重構胚用Ion激活5min后,放入含2mmol/L 6-DMAP和5μg/mL CHX的培養(yǎng)液中分別培養(yǎng)1h、2h、3h,三組重構胚的分裂率沒有顯著差異(P＞0.05),但囊胚率隨處理時間延長而呈現(xiàn)降低趨勢,當時間延長到3h時,囊胚率顯著低于1h組(13.89％vs28.57％,P＜0.05)。
　　 2、探討了TSA處理核移

3、植供體細胞或克隆重構胚對兔轉基因克隆胚胎早期發(fā)育的影響。轉EGFP基因的兔胎兒成纖維細胞分別用濃度為5nmol/L、25 nmol/L、50nmol/L TSA處理24h后進行核移植,結果發(fā)現(xiàn),當TSA濃度為5nmol/L時,重構胚的分裂率和囊胚率顯著高于對照組(0nmol/L)(482.61％vs72.09％;41.30％vs26.74％,P＜0.05),而25nmol/L組與對照組之間沒有顯著差異(P＞0.05),而濃度增加到50n

4、mol/L時,重構胚的分裂率與囊胚率顯著低于對照組(51.95％vs72.09％;11.69％vs26.74％,P＜0.05)。轉EGFP基因克隆重構胚分別經(jīng)5nmol/L、50nmol/L、100nmol/L的TSA處理6h后發(fā)現(xiàn),50nmol/L組的重構胚分裂率(84.09％)顯著高于對照組(70.24％)、5nmol/L(75.00％)組和100nmol/L組(71.76％)(P＜0.05),囊胚率(42.05％)顯著高于對照組(

5、27.38％)和100nmol/L組(25.88％)(P＜0.05)。用50nmol/L TSA分別處理重構胚3h、6h、9h后,6h組的分裂率和囊胚率顯著高于對照組(83.17％vs70.51％;41.58％vs26.92％,P＜0.05),而3h、9h組與對照組沒有顯著差異(P＞0.05)。將196枚經(jīng)TSA處理過的轉基因兔體細胞克隆胚胎分別移植給10只受體兔,其中1只懷孕到期,產(chǎn)下2只克隆兔。
　　 以上結果表明:(1)兔