1、隨著生物學研究范圍的不斷擴展，我們經常會遇到一些無法直接擴增的目標分子，然而又由于其濃度較低而無法進行檢測，傳統(tǒng)的分析方法不能檢測含量太低的目標物質，因此，信號放大技術的發(fā)展已成為當前生化分析領域的一個重要研究方向，在生物化學分析中，常見的信號放大技術主要有工具酶信號放大、金納米信號放大、生物條碼信號放大等，這些信號放大技術被廣泛應用于蛋白質、核酸、小分子等物質的檢測。本文采用熒光分析方法，構建了基于DNA分子機器、核酸適配體識別技術、

2、DNA酶識別元件引發(fā)的靶替代循環(huán)放大方法以及酶循環(huán)放大方法，實現(xiàn)了生物活性小分子和基因的高靈敏度、高選擇性檢測。主要研究內容包括以下幾個方面:
　　1.構建了一種新型的多重循環(huán)的DNA分子機器，利用等溫循環(huán)鏈置換聚合反應，結合熒光分析方法對ATP進行檢測。首先，以磁珠作為DNA引物鏈及ATP適體的固載物，適體與ATP結合釋放出引物鏈，在Klenow聚合酶的作用下，引物鏈雜交延伸釋放熒光探針，同時形成雙鏈DNA。在雙鏈DNA上設計了

3、兩個限制性內切酶的識別位點，經過內切酶的特異性切刻后，釋放兩條引物鏈，并進一步引發(fā)鏈置換反應，釋放出更多的熒光探針，最終達到放大信號的作用。在最佳反應條件下，實驗的檢測限為1.0×10-8 mol·L-1，可用于實際樣品細胞勻漿中ATP的測定。該方法設計簡單，操作方便，靈敏度高且具有良好的選擇性。
　　2.利用滾環(huán)擴增技術和發(fā)卡探針自組裝技術，設計了新穎的循環(huán)放大體系對目標DNA進行熒光檢測。首先將目標DNA與鎖扣DNA進行雜交反

4、應，將目標DNA結合到模板上。在T4 DNA連接酶的作用下鎖扣DNA形成環(huán)狀DNA，結合Phi29 DNA聚合酶的聚合生長作用，進行滾環(huán)擴增反應形成一條長的DNA鏈，長鏈DNA上有多個重復的DNA片段可以作為發(fā)卡探針自組裝的引物，反應后釋放熒光探針，通過多重循環(huán)放大技術，實現(xiàn)了對目標DNA的高靈敏度、高選擇性檢測。
　　3.設計了基于滾環(huán)擴增技術的DNA分子機器，運用熒光信號實現(xiàn)對目標DNA的靈敏度檢測。該方法利用目標DNA與環(huán)狀

5、DNA結合，在Phi29 DNA聚合酶和dNTPs的作用下發(fā)生滾環(huán)擴增反應，生成大量的長鏈DNA。滾環(huán)擴增反應產生大量的重復的DNA片段，該片段與信號探針結合后存在Mg2+的剪切位點，當體系中加入一端修飾熒光基團、一端修飾猝滅基團的信號DNA探針(F/Q)時，與滾環(huán)擴增的產物進行堿基互補配對，在Mg2+存在的情況下，能夠識別特殊位點rA并進行剪切，使熒光基團與猝滅基團之間的距離增大，呈現(xiàn)出熒光信號，通過對熒光信號強度的檢測實現(xiàn)對目標DN