1、本文通過以下幾個(gè)部分展開論述：
　　第一章以搭“積木”方法設(shè)計(jì)的低毒性甲型流感病毒進(jìn)入抑制劑
　　目的:
　　本研究旨在研發(fā)作用于血凝素蛋白的病毒進(jìn)入抑制劑，并降低藥物的毒性、提高選擇性，使其具有開發(fā)成為抗流感病毒藥物的潛力。以搭“積木”的方法設(shè)計(jì)一組新型的抗甲型流感病毒復(fù)合多肽。這些多肽由兩段多肽片段（積木）組成，分別命名為Jp序列(ARLPR)和Hp序列(KKWK)。將Jp分別連接到Hp的C-末端和N-末端就構(gòu)成了

2、復(fù)合肽庫。復(fù)合肽因此具有Cn-Hp-Jp和Cn-Jp-Hp的基本結(jié)構(gòu)，其中n為不同長(zhǎng)度的脂肪酸鏈。同時(shí)對(duì)這些復(fù)合肽的抗流感病毒活性、毒性、以及作用機(jī)制進(jìn)行研究。
　　方法:
　　1、通過Fmoc多肽固相合成方法快速、高效地合成了系列多肽，并對(duì)多肽的結(jié)構(gòu)進(jìn)了修飾改造，純化得到最終產(chǎn)物，化合物純度達(dá)到或高于90％，可用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。
　　2、采用致細(xì)胞病變效應(yīng)實(shí)驗(yàn)(CPE)對(duì)合成修飾后的多肽進(jìn)行了活性篩選，并對(duì)抗病毒活

3、性較好的多肽C20-Jp-Hp進(jìn)行廣譜的抗流感病毒活性測(cè)試，測(cè)試病毒株包括甲型流感病毒株A/Puerto Rico/8/34(H1N1)、A/Aichi/2/68(H3N2)、小鼠致病性病毒株A/FM/1/47(H1N1)、NA-H274Y突變病毒株A/Puerto Rico/8/34(H1N1)、臨床分離A型病毒株690（H3亞型）、臨床分離A型病毒株699（H3亞型）、臨床分離B型流感病毒株等。
　　3、通過熒光實(shí)時(shí)定量PCR

4、、不同加藥模式實(shí)驗(yàn)、空斑實(shí)驗(yàn)、H5N1假病毒實(shí)驗(yàn)、VSVG假病毒實(shí)驗(yàn)、神經(jīng)氨酸酶抑制實(shí)驗(yàn)等方法，探索C20-Jp-Hp的作用靶點(diǎn)。
　　4、探究C20-Jp-Hp作用于HA2亞基融合區(qū)域的研究:利用血凝抑制實(shí)驗(yàn)研究化合物的作用靶點(diǎn)是否在流感病毒包膜表面的血凝素蛋白的HA1亞基上。在溶血實(shí)驗(yàn)中，病毒在酸性條件下能引起病毒與紅細(xì)胞膜融合，引起紅細(xì)胞溶血反應(yīng)。加入C20-Jp-Hp測(cè)定酸性條件下血紅細(xì)胞上清的OD值。為了進(jìn)一步確證C20

5、-Jp-Hp作用于HA2亞基的融合區(qū)域，進(jìn)行了圓二色譜實(shí)驗(yàn)和計(jì)算機(jī)模擬分析。
　　結(jié)果:
　　1、在抗流感病毒活性篩選實(shí)驗(yàn)中，我們得到化合物C20-Jp-Hp對(duì)流感病毒A/PuertoRico/8/34(H1N1)的IC50值為0.53μM，同時(shí)顯示出低毒性和高選擇性的特點(diǎn)。
　　2、在預(yù)處理病毒組和同時(shí)加藥組的實(shí)驗(yàn)組中，C20-Jp-Hp表現(xiàn)出較好的抗流感病毒活性;初步確定C20-Jp-Hp作用于流感病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞

6、的早期階段。同時(shí)，通過H5N1假病毒和VSVG假病毒實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，C20-Jp-Hp對(duì)H5N1假病毒有抑制活性，對(duì)VSVG假病毒并沒有抑制活性。因此，可能的作用靶點(diǎn)為血凝素蛋白、神經(jīng)氨酸酶蛋白，或者對(duì)兩種蛋白均有作用。利用神經(jīng)氨酸酶抑制實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證C20-Jp-Hp是否具有神經(jīng)氨酸酶抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，C20-Jp-Hp無抑制神經(jīng)氨酸酶的活性。由此推斷，這類化合物可能的作用靶點(diǎn)在血凝素蛋白HA上。
　　3、C20-Jp-Hp不能抑制病

7、毒引起血凝現(xiàn)象，因此表明C20-Jp-Hp不作用于HA1亞基以阻止病毒吸附宿主細(xì)胞。在溶血實(shí)驗(yàn)中，加入C20-Jp-Hp后，發(fā)現(xiàn)該化合物能在酸性條件下抑制病毒的HA蛋白構(gòu)象變化，抑制溶血反應(yīng)。所以，C20-Jp-Hp的作用靶點(diǎn)可能在HA蛋白的HA2亞基上，抑制HA蛋白構(gòu)象的變化。
　　4、圓二色譜實(shí)驗(yàn)和計(jì)算機(jī)模擬分析。圓二色譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)C20-Jp-Hp能使來自HA2亞基融合肽部分的HA-FP-O的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，因此可以推斷

8、C20-Jp-Hp能與HA2亞基融合肽部分相互作用;計(jì)算機(jī)模擬也得到相應(yīng)的結(jié)果;由此可知，C20-Jp-Hp能與HA2亞基的融合區(qū)域相結(jié)合，從而阻止HA構(gòu)象的變化。
　　結(jié)論:
　　1、通過“積木”拼接的設(shè)計(jì)方法可以設(shè)計(jì)出一類新的抗甲型流感病毒的脂肽類化合物。這類化合物不但具有廣譜的抗甲型流感病毒活性，而且具有低毒性和高選擇性的特點(diǎn)，有開發(fā)為新型的抗甲型流感病毒藥物的潛力。
　　2、以C20-Jp-Hp作為先導(dǎo)化合物進(jìn)

9、行抗甲型流感病毒的機(jī)制研究。C20-Jp-Hp在病毒感染宿主的早期階段與HA2亞基中的一段保守的融合肽相互作用，抑制HA2亞基的構(gòu)象變化，阻止病毒與宿主細(xì)胞膜的膜融合。
　　3、流感病毒的融合肽作為HA2亞基中的一段極保守的序列，在病毒包膜與宿主細(xì)胞膜融合過程中起著重要的作用，因此是抗病毒藥物有效的作用靶點(diǎn)。
　　第二章以膽甾醇為“特洛伊木馬”的作用于血凝素蛋白保守區(qū)域的甲型流感病毒進(jìn)入抑制劑
　　目的:
　　基

10、于前一章的研究，對(duì)復(fù)合肽進(jìn)行了結(jié)構(gòu)改造，以膽甾醇作為“特洛伊木馬”連接到抗甲型流感病毒的主要作用部分KKWK上，組成新的S-KKWK短脂肽庫。本研究設(shè)計(jì)、合成獲得了新型的抗甲型流感病毒進(jìn)入抑制劑S-KKWK，并探究其在HA2亞基上作用的靶點(diǎn)，為抗流感病毒藥物分子的設(shè)計(jì)提供了指導(dǎo)。
　　方法:
　　1、通過Fmoc多肽固相合成方法快速、高效地合成了系列多肽，并對(duì)多肽的結(jié)構(gòu)進(jìn)了修飾改造，純化得到最終產(chǎn)物，化合物純度達(dá)到或高于90

11、％，可用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。
　　2、采用致細(xì)胞病變效應(yīng)實(shí)驗(yàn)(CPE)對(duì)合成修飾后的多肽進(jìn)行了活性篩選，并對(duì)抗病毒活性較好的多肽S-KKWK進(jìn)行廣譜的抗流感病毒活性測(cè)試。
　　3、通過熒光實(shí)時(shí)定量PCR、不同加藥模式實(shí)驗(yàn)、熒光免疫顯微鏡觀察、H5N1假病毒實(shí)驗(yàn)、VSVG假病毒實(shí)驗(yàn)、神經(jīng)氨酸酶抑制實(shí)驗(yàn)等方法，探索S-KKWK的作用靶點(diǎn)。
　　4、對(duì)S-KKWK的作用機(jī)制和作用位點(diǎn)的研究:利用血凝抑制實(shí)驗(yàn)研究化合物的作用靶點(diǎn)

12、是否為流感病毒包膜表面的血凝素蛋白的HA1亞基;溶血抑制實(shí)驗(yàn)研究S-KKWK的作用靶點(diǎn)是否在HA蛋白的HA2亞基上。為了確證S-KKWK的作用靶點(diǎn)，進(jìn)行了表面等離子共振(SPR)實(shí)驗(yàn)、圓二色譜實(shí)驗(yàn)和計(jì)算機(jī)模擬分析。利用SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)考馬斯亮藍(lán)染色，進(jìn)一步檢測(cè)S-KKWK是否能抑制HA蛋白酶解反應(yīng);測(cè)定了經(jīng)S-KKWK處理后的病毒溶液的滴度(TCID50)，確定S-KKWK是否具有直接殺滅病毒的效果。
　　結(jié)果:
　　1

13、、化合物S-KKWK對(duì)流感病毒A/Puerto Rico/8/34(H1N1)的IC50值為1.26±0.15μg/mL，同時(shí)對(duì)H1N1和H3N2流感病毒都具有抗病毒活性，具有廣譜、高效的抑制流感病毒活性的特點(diǎn)。
　　2、在預(yù)處理病毒組和同時(shí)加藥組的實(shí)驗(yàn)組中，S-KKWK表現(xiàn)出較好的抗流感病毒活性;初步確定S-KKWK作用于流感病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的早期階段。同時(shí)，通過H5N1假病毒和VSVG假病毒實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，S-KKWK對(duì)H5N1假病

14、毒有抑制活性，對(duì)VSVG假病毒并沒有抑制活性;因此，可能的作用靶點(diǎn)為血凝素蛋白、神經(jīng)氨酸酶蛋白，或者對(duì)兩種蛋白均有作用。利用神經(jīng)氨酸酶抑制實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證S-KKWK是否具有神經(jīng)氨酸酶抑制作用。結(jié)果表明，S-KKWK無抑制神經(jīng)氨酸酶的活性。由以上實(shí)驗(yàn)可以推斷，這類化合物可能的作用靶點(diǎn)在血凝素蛋白HA上。
　　3、在SPR實(shí)驗(yàn)中，S-KKWK能與HA蛋白相結(jié)合，親和常數(shù)KD值為5.35 nM。因此，S-KKWK是作用于HA蛋白的進(jìn)入抑制劑。

15、S-KKWK不能抑制病毒引起血凝現(xiàn)象，因此表明S-KKWK不作用于HA1亞基以阻止病毒吸附宿主細(xì)胞。在溶血實(shí)驗(yàn)中，加入S-KKWK后，發(fā)現(xiàn)該化合物能在酸性條件下抑制病毒的HA蛋白構(gòu)象變化，抑制溶血反應(yīng)。同時(shí)，在SPR實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)S-KKWK能與HA2亞基相結(jié)合，親和常數(shù)KD值為16.3 nM。所以，S-KKWK的作用靶點(diǎn)可能在HA蛋白的HA2亞基上，抑制HA蛋白構(gòu)象的變化，以達(dá)到抑制流感病毒的效果。
　　4、經(jīng)圓二色譜實(shí)驗(yàn)和計(jì)算機(jī)模

16、擬分析發(fā)現(xiàn)，S-KKWK不能使來自HA2亞基融合肽部分的HA-FP-O的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。通過計(jì)算機(jī)模擬得到在HA2亞基的莖部存在一保守的“疏水性口袋”能與SKKWK相互作用。由此可知，S-KKWK能與HA2亞基的一疏水區(qū)域相結(jié)合，從而阻止HA構(gòu)象的變化，阻止病毒進(jìn)入宿主。
　　結(jié)論:
　　1、S-KKWK是對(duì)H1N1和H3N2流感病毒都具有抗病毒活性的化合物，且S-KKWK及其衍生物對(duì)神經(jīng)氨酸酶抑制劑耐藥的病毒株也有抗病毒

17、活性。據(jù)此推測(cè)S-KKWK具有不同于神經(jīng)氨酸酶抑制劑的作用機(jī)制。S-KKWK是對(duì)流感病毒感染的早期階段有效，能與HA蛋白相互作用，因此屬于病毒進(jìn)入抑制劑。
　　2、S-KKWK不能作用于HA1的唾液酸結(jié)合位點(diǎn)從而抑制病毒吸附宿主細(xì)胞，而是作用于HA2亞基莖部的螺旋結(jié)構(gòu)，即通過作用于HA2亞基上一保守的由疏水性氨基酸Val48、Val55(Ile55、H3)、Ile56、Leu99、Val100、Leu108等殘基所組成的“疏水口袋