1、干細(xì)胞移植治療心肌梗死是最有希望使心肌再生的方法，是近十余年來該研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，未來發(fā)展的主要方向之一。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymalstem cells，MSCs)由于其獲取和擴(kuò)增方便，有多向分化能力，可以自體移植及異體移植有免疫豁免功能等優(yōu)點(diǎn)而倍受青睞，是近年來用于臨床研究最常見的干細(xì)胞之一。但是，臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，干細(xì)胞移植治療后遠(yuǎn)期獲益不明顯，全因死亡率等主要臨床終點(diǎn)改善不佳。究其原因主要是干細(xì)胞移植后面臨心肌局部血流

2、的沖擊和細(xì)胞壞死后產(chǎn)生的過氧化物損傷，導(dǎo)致干細(xì)胞的滯留率和存活率都很低。如能為移植的干細(xì)胞提供一個(gè)暫時(shí)的“安身的場(chǎng)所”，并對(duì)干細(xì)胞的功能進(jìn)行調(diào)控，增強(qiáng)其抵抗心梗局部過氧化微環(huán)境損傷，則有希望提高干細(xì)胞的存活和滯留，從而發(fā)揮其應(yīng)有的作用。
　　可注射性心肌組織工程(Injectable cardiac tissue engineering)是將可注射性支架材料通過心內(nèi)膜或心外膜局部注射到心肌病變位置進(jìn)行治療。一般是指具有三維網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)

3、構(gòu)的水凝膠，具有一定的韌性和粘稠度，富含水分達(dá)95％以上，可以攜帶藥物或者細(xì)胞進(jìn)行治療。研究表明，水凝膠可以作為細(xì)胞移植的載體，能夠粘附包裹移植細(xì)胞，在一定程度上減少因?yàn)闈B漏或者血流沖擊造成的細(xì)胞流失，增加細(xì)胞在目標(biāo)位點(diǎn)的滯留時(shí)間和數(shù)量而發(fā)揮其應(yīng)有的作用;另外，用可注射性水凝膠進(jìn)行心肌組織工程治療可以增加室壁厚度，為心室壁提供一個(gè)機(jī)械支撐力，從而減少心室張力，改善心室重構(gòu)，改善心功能，當(dāng)水凝膠的機(jī)械力學(xué)性質(zhì)類似于健康心肌，這個(gè)效果更顯著

4、。
　　冠脈梗塞后由于局部心肌缺血缺氧，或者由于血管重建再通導(dǎo)致的再灌注損傷，心肌細(xì)胞及成纖維細(xì)胞等在代謝過程中可以產(chǎn)生一系列活性氧簇(Reactive oxygenspecies，ROS)，主要包括:O2-、H2O2、HO2·和·OH等，對(duì)心肌細(xì)胞和外源性移植的干細(xì)胞都可以造成嚴(yán)重?fù)p傷。如能開發(fā)出具有抗氧化作用的水凝膠，不僅能發(fā)揮水凝膠的機(jī)械支撐作用，而且可以有效降低梗死區(qū)局部ROS水平，保護(hù)細(xì)胞免受損傷，提高細(xì)胞移植后的存活率

5、。
　　葛根素(化學(xué)名為8-β-D-葡萄糖吡喃糖-7，4'-二羥基異黃酮，puerarin)是從野葛的干燥根中提取分離得到的主要活性成分，是一種異黃酮類化合物。研究顯示:葛根素能夠清除超氧化物陰離子，抑制由過氧化氫引起的紅細(xì)胞溶血損傷和脂質(zhì)過氧化物的生成;能保護(hù)過氧化誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞和PC12細(xì)胞損傷，有很好的保護(hù)細(xì)胞，抗過氧化的作用;基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究表明葛根素這種保護(hù)細(xì)胞與抗凋亡的作用的可能機(jī)制為:(1)葛根素分子可以提供質(zhì)子耦合機(jī)體

6、過量的ROS，直接破壞H2O2分子，降低細(xì)胞內(nèi)的過氧化水平，從而減少其對(duì)細(xì)胞的損傷;(2)提高M(jìn)SCs的內(nèi)源性抗氧化酶，比如SOD酶、GSH-PX等酶的活性，提高細(xì)胞自身抗氧化防御系統(tǒng)對(duì)過氧化陰離子的清除能力;(3)葛根素能直接參與損傷細(xì)胞DNA的修復(fù)。因此，面對(duì)細(xì)胞移植后心梗局部的過氧化微環(huán)境損傷，葛根素有望能夠調(diào)控干細(xì)胞移植后的存活。
　　如能開發(fā)出葛根素類水凝膠進(jìn)行心肌組織工程治療，不僅能夠?yàn)楣Ｈ笮氖姨峁C(jī)械支撐力，包載移

7、植細(xì)胞減少細(xì)胞的流失，而且可以發(fā)揮葛根素抗氧化保護(hù)細(xì)胞的作用，進(jìn)一步增加移植細(xì)胞的滯留和存活，使其發(fā)揮最大功效。
　　載藥水凝膠的構(gòu)建一般包括化學(xué)鍵鍵合和物理包裹的形式，在前者中藥物既成為藥物釋放的對(duì)象又是載體的一部分，能夠明顯提高藥物包載率，但是較后者在材料的選擇和制作工藝上有更高的要求。我們課題組在嘗試采用葛根素鍵合多肽構(gòu)建水凝膠的過程中發(fā)現(xiàn)，葛根素本身不進(jìn)行任何的化學(xué)修飾就能夠通過簡易的工藝和促發(fā)方式自組裝形成水凝膠。結(jié)合葛

8、根素的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其他成膠體系的成膠原理，我們推測(cè)葛根素水凝膠(Puerarin hydrogel，PG)的成膠原理可能為:葛根素分子結(jié)構(gòu)中既含有親水的葡萄吡喃糖結(jié)構(gòu)也有相對(duì)疏水的異黃酮結(jié)構(gòu)，在常溫下處于微溶物質(zhì)，在加熱下可以使其完全溶解，冷卻時(shí)可以通過分子間苯環(huán)堆疊力、疏水作用力和氫鍵作用自組裝形成具有三維纖維網(wǎng)絡(luò)的膠體結(jié)構(gòu)。葛根素水凝膠是迄今為止發(fā)現(xiàn)的第一種能自己形成小分子水凝膠的天然藥物。葛根素水凝膠的發(fā)現(xiàn)具有明顯的優(yōu)勢(shì):(1)由于

9、成份只有葛根素本身，因此其藥物包載率是100％，是藥物包載率最高的藥物載體，其藥物釋放是通過膠體的緩慢降解實(shí)現(xiàn);(2)制作工藝和成膠方式簡便;(3)通過加熱冷卻后約數(shù)分鐘成膠，為其可注射性創(chuàng)造條件。接著，課題組對(duì)葛根素水凝膠進(jìn)行研究，主要包括水凝膠的物理化學(xué)性能表征和生物學(xué)相容性檢測(cè)，體外觀察葛根素水凝膠在過氧化環(huán)境下保護(hù)MSCs的能力，葛根素水凝膠攜帶MSCs體內(nèi)移植大鼠心肌梗死模型的研究。研究分以下三部分進(jìn)行:
　　第一部分:

10、葛根素水凝膠的物理化學(xué)性能表征和生物學(xué)相容性檢測(cè)
　　我們對(duì)葛根素水凝膠表征時(shí)觀察到，其最低成膠濃度為1％，并且為均勻的透明頭膠體，隨著膠體濃度增高，其透明性有所減弱，6％時(shí)形成乳白色的不透明的水凝膠;通過透射電鏡表征水凝膠的自組裝形貌:葛根素水凝膠為三維網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，各個(gè)濃度的水凝膠均形成較長的納米纖維，纖維直徑大約為10-50nm，1％、2％和4％形成的纖維長度及直徑均相似;力學(xué)性能表征發(fā)現(xiàn)，葛根素水凝膠是非頻率依賴性，而是應(yīng)力

11、依賴型膠體，2％和4％的葛根素水凝膠處于穩(wěn)定狀態(tài)時(shí)的力學(xué)強(qiáng)度約為10KPa，這與心肌組織的力學(xué)強(qiáng)度相似，適合進(jìn)行心肌組織工程研究;體外藥物釋放實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):在生理環(huán)境下，2％和4％濃度的水凝膠在前12h以較快的速率釋放葛根素藥物，藥物可以持續(xù)釋放12h以上;細(xì)胞相容性實(shí)驗(yàn)表明:CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示葛根素水凝膠與心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞均有良好的細(xì)胞相容性，無明顯細(xì)胞毒害作用;
　　第二部分:葛根素水凝膠在過氧化環(huán)境下保護(hù)MSCs的能

12、力研究及機(jī)制探討
　　本實(shí)驗(yàn)采用100μmol/L H2O2干預(yù)1h作為外源性ROS模擬體內(nèi)心肌梗死后的過氧化環(huán)境。實(shí)驗(yàn)分5組進(jìn)行:正常MSCs組、H2O2干預(yù)組、H2O2+2％PG組、H2O2+4％PG組和H2O2+6％PG組。通過檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的SOD活性、MDA含量和ROS熒光探針DHE的水平可以反映細(xì)胞內(nèi)ROS的含量，與正常MSCs組比較，H2O2干預(yù)組細(xì)胞內(nèi)MDA含量和SOD活性增加，DHE紅色熒光數(shù)量明顯增加，而2％、4％

13、和6％濃度的葛根素水凝膠可以顯著減少SOD活性和MDA含量，DHE紅色熒光明顯減少;用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞存活和增殖，培養(yǎng)基中LDH的釋放反映細(xì)胞毒性的大小，AO/EB染色從細(xì)胞形態(tài)學(xué)上觀察細(xì)胞的存活和凋亡，AnnexinV-FITC/PI雙染凋亡檢測(cè)法檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率，這些檢測(cè)結(jié)果表明H2O2誘導(dǎo)后細(xì)胞存活減少、死亡增加，2％、4％和6％的葛根素水凝膠均可明顯降低氧化應(yīng)激后MSCs的凋亡率，增加細(xì)胞存活;Western blot分析顯示

14、2％、4％和6％的葛根素水凝膠可使抑制細(xì)胞凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)增加和促凋亡蛋白Bax和Caspase-3表達(dá)減少，從蛋白水平印證了細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化。這些結(jié)果均表明H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞ROS的產(chǎn)生及細(xì)胞存活減少、凋亡增多，而通過2％、4％和6％的葛根素水凝膠培養(yǎng)細(xì)胞均可以抑制ROS的產(chǎn)生，保護(hù)細(xì)胞減少細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能是通過減少促凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表達(dá)和增加抑制細(xì)胞凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)產(chǎn)生作用。
　　第三部分:

15、葛根素水凝膠在MSCs移植治療大鼠心肌梗死中的作用及機(jī)制研究
　　在本部分研究中，我們將可注射性葛根素水凝膠攜帶MSCs移植治療大鼠心肌梗死模型，以觀察其對(duì)移植細(xì)胞的滯留存活、大鼠心功能和心臟結(jié)構(gòu)的改善作用。實(shí)驗(yàn)采用心臟超聲對(duì)移植后心功能的變化進(jìn)行評(píng)價(jià);HE染色、Masson染色檢測(cè)移植后心臟組織的形態(tài)學(xué)變化，包括室壁厚度，心梗面積和心肌纖維化程度;用免疫熒光評(píng)價(jià)心梗部位心肌和血管新生情況，Western blot檢測(cè)抗凋亡蛋白和

16、促凋亡蛋白的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn):細(xì)胞移植后4周，4％PG+MSCs組較單純MSCs組的細(xì)胞滯留及存活明顯增加;移植治療術(shù)后4周，心彩超心功能檢測(cè)提示4％PG+MSCs組、MSCs組和4％PG水凝膠聯(lián)合MSCs組均能改善左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)，增加心室短軸縮短率(FS)，但4％PG+MSCs組改善更加明顯;組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)顯示4％PG、MSCs組和4％PG+MSCs組均能改善心梗后室壁厚度，減少心梗面積，減少心肌纖維化程度，減少心肌損傷，增加

17、血管新生，增加心肌組織數(shù)量，且葛根素水凝膠聯(lián)合MSCs治療組的效果更加明顯。
　　綜述所述，本研究成功制備葛根素水凝膠，其成份只有葛根素，是現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)的第一種能自組裝形成水凝膠的天然藥物，其具有與心肌組織相近的力學(xué)強(qiáng)度，能夠平穩(wěn)釋放葛根素藥物達(dá)12小時(shí)以上，具有良好的心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞相容性;葛根素是一種強(qiáng)抗氧化劑，可以減少H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞ROS水平，增加細(xì)胞存活，減少細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的產(chǎn)生，其機(jī)制可能與其抑制凋

18、亡有關(guān);葛根素水凝膠能夠提高移植細(xì)胞在心梗局部的滯留和存活，促進(jìn)MSCs改善心功能和心室重構(gòu)的治療效果，其機(jī)制可能是通過抗氧化，減少細(xì)胞凋亡，促進(jìn)血管新生，改善心梗微環(huán)境的作用修復(fù)心梗組織。本研究從干細(xì)胞移植治療的不足這一關(guān)鍵臨床問題出發(fā)，緊密結(jié)合生物材料學(xué)與心肌組織工程學(xué)，研制了葛根素水凝膠并對(duì)其抗過氧化、保護(hù)細(xì)胞的生物學(xué)效用進(jìn)行研究，并包裹干細(xì)胞移植治療動(dòng)物心梗模型，闡明其改善心梗微環(huán)境與促進(jìn)心梗修復(fù)的作用及可能機(jī)制，對(duì)于心肌組織工