1、第一部分糖尿病致小鼠單核/巨噬細(xì)胞SIRT1失活和對致炎物質(zhì)敏感性增強(qiáng)
　　目的：本實(shí)驗(yàn)通過整體、細(xì)胞、分子水平不同層次研究正常、高糖、高糖給予白藜蘆醇(Res)環(huán)境下沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)的變化與外周血單核細(xì)胞炎癥功能的改變及對糖尿病心功能改善情況的影響。
　　方法：
　　1.體內(nèi)試驗(yàn)：SPF級C57BL/6小鼠隨機(jī)分為3組，正常對照組(Con組)，糖尿病組(DM組)，糖尿病給予白藜蘆醇組(DM+Res組)

2、。糖尿病成模后8周，用小動物超聲法測3組小鼠心臟舒張功能的變化；取各組小鼠外周血單核巨噬細(xì)胞用流式細(xì)胞技術(shù)測SIRT1的表達(dá)；取各組心臟石蠟組織切片進(jìn)行SIRT1、CCR2（趨化因子2受體）及炎癥因子的免疫組織化學(xué)染色，Western blot檢測 SIRT1、CCR2、CX3CR1的蛋白表達(dá)，雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）測定觀察高糖誘導(dǎo)外周血單核巨噬細(xì)胞及心臟的組織炎癥反應(yīng)變化。
　　2.體外試驗(yàn)：以培養(yǎng)巨噬細(xì)胞系RAW2

3、64.7細(xì)胞株為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?；?yīng)用不同濃度終末糖基化產(chǎn)物（AGEs）刺激RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)， ELISA法測定炎癥因子IL-1β，TNF-α；用Western blot檢測SIRT1、CCR2及Acetyl-NFκB的蛋白水平；應(yīng)用AGEs刺激RAW264.7細(xì)胞制備成高糖模型，觀察 Res及 Ex527對高糖炎癥的影響，同時(shí)應(yīng)用熒免疫熒光及 Western blot法檢測SIRT1、Acetyl-NFκBp65及炎癥因子的表

4、達(dá)及用Transwell小室檢測RAW264.7細(xì)胞的遷移能力。
　　結(jié)果：
　　1.與Con組小鼠相比，DM組小鼠血糖隨著時(shí)間的推移顯著上升，體重顯著下降，心肌細(xì)胞排列紊亂、疏松，橫紋肌逐漸消失，心臟舒張功能發(fā)生障礙；給予SIRT1激動劑Res后DM小鼠心肌細(xì)胞排列得到改善，心肌細(xì)胞丟失減少，舒張功能改善。
　　2. DM組小鼠外周血單核/巨噬細(xì)胞和心肌組織SIRT1表達(dá)水平顯著降低，而心肌組織CCR2的表達(dá)明顯增加

5、，外周血單核/巨噬細(xì)胞M1型ly-6chigh與M2型ly-6clow的比值增加，CCR2/CX3CR1比值也明顯增加，細(xì)胞向炎癥表型偏移；給予 SIRT1激動劑Res后SIRT1表達(dá)水平比DM組明顯增加，而心肌組織CCR2的表達(dá)明顯減少，外周血單核/巨噬細(xì)胞M1型ly-6chigh與M2型ly-6clow的比值降低，CCR2/CX3CR1比值也明顯降低，細(xì)胞向抗炎表型偏移。
　　3.各組小鼠外周血單核/巨噬細(xì)胞炎癥因子IL-1β

6、及TNF-α水平變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；當(dāng)體外給予生理濃度的Hydr（氫化可的松）預(yù)處理，再給予促炎劑LPS（脂多糖）刺激細(xì)胞，各組炎癥因子 IL-1β及TNF-α水平明顯增加；DM組較正常組小鼠炎癥因子 IL-1β及TNF-α水平顯著增加，而給予SIRT1激動劑Res治療組相對于DM組小鼠炎癥因子明顯降低。
　　4. AGEs體外處理劑量依賴性抑制RAW264.7細(xì)胞SIRT1蛋白表達(dá)的同時(shí)，刺激CCR2、Acetyl-NFκBp65

7、、IL-1β及TNF-α蛋白水平的表達(dá)，NF-κBp65乙?；鰪?qiáng)，CCR2/CX3CR1比值增加，細(xì)胞向促炎表型偏移，炎癥因子IL-1β及TNF-α分泌增多，細(xì)胞遷移、趨化能力增強(qiáng)。SIRT1激動劑 Res可以逆轉(zhuǎn) AGEs的作用，下調(diào)Acetyl-NFκBp65蛋白的表達(dá)，降低CCR2/CX3CR1比值，降低炎癥因子的產(chǎn)生，細(xì)胞遷移、趨化能力顯著降低，與 AGEs組比較差異具有顯著性；而抑制SIRT1通路作用則相反。
　　小結(jié)

8、：
　　1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明糖尿病抑制SIRT1蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)外周血單核/巨噬細(xì)胞向炎癥表型偏移，促進(jìn)糖尿病心肌組織炎癥反應(yīng)及心臟舒張功能障礙；白藜蘆醇激活SIRT1使外周血單核/巨噬細(xì)胞向抗炎表型偏移，改善糖尿病心肌病變和心臟舒張功能。
　　2.體外實(shí)驗(yàn)表明AGEs降低RAW264.7細(xì)胞SIRT1蛋白的表達(dá)，CCR2/CX3CR1比值增加細(xì)胞，細(xì)胞向促炎表型偏移，誘導(dǎo)產(chǎn)生炎癥因子，細(xì)胞遷移和趨化能力增強(qiáng)；Res激活SIRT

9、1使NF-κBp65去乙酰化，降低CCR2/CX3CR1比值，抑制RAW264.7細(xì)胞遷移和趨化，從而抑制RAW264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)。
　　第二部分單核/巨噬細(xì)胞SIRT1失活加重糖尿病小鼠梗死心臟的炎癥反應(yīng)和功能障礙
　　目的：探討通過激活 SIRT1調(diào)控糖尿病心肌梗死急性期單核巨噬細(xì)胞表型，觀察對糖尿病心肌梗死心肌重塑及遠(yuǎn)期心臟功能的影響及作用機(jī)制。
　　方法：用正常小鼠心肌梗死模型和1型糖尿病小鼠合并急性心肌梗

10、死模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。心肌梗死手術(shù)統(tǒng)一在糖尿病第5周進(jìn)行。糖尿病成模至心肌梗死手術(shù)后2周持續(xù)對DMI+Res組給予Res灌胃治療。用高分辨率小動物超聲成像系統(tǒng)檢測小鼠心臟收縮和舒張功能；Masson三色染色法檢測心肌纖維化情況；免疫組化方法檢測炎癥因子和毛細(xì)血管密度；取各組小鼠外周血單核巨噬細(xì)胞用流式細(xì)胞技術(shù)測 ly-6c、SIRT1的表達(dá)，用 ELISA法檢測炎癥因子 IL-1β，TNF-α的表達(dá)；Western blot方法檢測SIRT1

11、、CCR2和Acetyl-NFκB的蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1. LAD（冠狀動脈左前降支）結(jié)扎后小鼠心功能明顯受損，左心室收縮末期內(nèi)徑（LVIDs）和舒張末期內(nèi)徑（LVIDd）比正常小鼠顯著增加，左心室射血分?jǐn)?shù)（EF）和短軸縮短率（FS）顯著降低，左心室壁變?。恍∈笮呐K體重比明顯增加；梗死周邊區(qū)心肌細(xì)胞排列紊亂，心肌細(xì)胞減少，成纖維細(xì)胞大量增生，心肌梗死區(qū)嚴(yán)重纖維化。
　　2.與正常急性心肌梗死（AMI）組相

12、比，糖尿病急性心肌梗死（DMI）組小鼠外周血單核細(xì)胞SIRT1表達(dá)明顯減少，ly-6chigh/ly-6clow及CCR2/CX3CR1比值升高， Acetyl-NFκBp65、IL-1β和TNF-α表達(dá)增加，給予SIRT1激動劑Res治療后，DMI組小鼠外周血單核細(xì)胞 SIRT1表達(dá)明顯升高，而 ly-6chigh/ly-6clow及 CCR2/CX3CR1比值降低，Acetyl-NFκBp65、IL-1β和TNF-α表達(dá)降低。

13、>　　3.與AMI組相比，DMI組小鼠左心室心肌梗死面積增大、心肌纖維化程度明顯加重，心臟血管密度降低；與此同時(shí)，DMI組小鼠LVIDs、LVIDd明顯增加，EF、FS明顯降低，給予SIRT1激動劑Res治療后，DMI組小鼠左心室心肌梗死面積、心肌纖維化程度改善，心臟血管密度增加，LVIDs、LVIDd明顯降低，EF、FS明顯升高。
　　小結(jié)：
　　1.與AMI組相比，I型糖尿病小鼠心肌梗死急性期外周血單核/巨噬細(xì)胞SIRT

14、1通路受損，細(xì)胞向炎癥表型偏移增多，心肌急性期炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，并伴隨心肌梗死遠(yuǎn)期心肌纖維化進(jìn)一步增加，心肌組織毛細(xì)血管密度進(jìn)一步降低，心臟收縮功能障礙進(jìn)一步加重。
　　2. SIRT1激動劑Res能改善I型糖尿病小鼠心肌梗死急性期單核/巨噬細(xì)胞向炎癥表型偏移，顯著降低心肌炎癥水平，同時(shí)增加1型糖尿病小鼠心肌梗死恢復(fù)期心肌組織毛細(xì)血管密度，減少梗死面積，減輕心肌纖維化，并改善梗死后的心肌收縮功能。
　　全文結(jié)論：
　　1.

15、 SIRT1通路受損誘導(dǎo)糖尿病心肌梗死急性期單核/巨噬細(xì)胞向炎癥表型偏移，炎癥水平增加，恢復(fù)期心肌組織毛細(xì)血管密度降低，心肌梗死面積、心肌纖維化增加，心功能障礙加重。
　　2. SIRT1通路激動劑Res能改善糖尿病誘導(dǎo)的外周血單核/巨噬細(xì)胞向炎癥表型偏移，抑制心血管炎癥，從而減少恢復(fù)期心肌梗死面積，減輕心肌纖維化程度，促進(jìn)血管新生，改善糖尿病心臟舒張功能。
　　3. AGEs體外處理降低RAW264.7細(xì)胞SIRT1蛋白的