1、[目的] 本實(shí)驗(yàn)利用體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞模型，運(yùn)用形態(tài)學(xué)觀察、免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)及相關(guān)生化指標(biāo)檢測(cè)等多種方法研究不同濃度的碘離子及碘分子對(duì)體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞增殖活性與功能的影響，探討碘對(duì)甲狀腺外組織的作用，豐富微量元素碘的實(shí)驗(yàn)研究。 [方法] 1．細(xì)胞株：人皮膚成纖維(HSF)細(xì)胞株，購(gòu)于協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心。常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)，待傳代穩(wěn)定后進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。 2．試劑配制及實(shí)驗(yàn)分組：碘化鉀，分析純

2、，以純水配制成為1000mgT/L母液，避光保存，以DMEM培養(yǎng)液稀釋待用。碘，分析純，以純水配制成飽和溶液，以化學(xué)滴定法測(cè)定其濃度，現(xiàn)配現(xiàn)用。本實(shí)驗(yàn)中，碘離子設(shè)1個(gè)空白對(duì)照組及50～15000μg/L中若干實(shí)驗(yàn)組；碘分子設(shè)1個(gè)空白對(duì)照組及50～4000μg/L中若干實(shí)驗(yàn)組。 3．細(xì)胞計(jì)數(shù)及形態(tài)學(xué)觀察：種24孔板，待細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的碘離子及碘分子，每板均設(shè)對(duì)照組，于作用4、12、24、48小時(shí)后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)及觀察細(xì)胞形態(tài)

3、學(xué)改變。 4．MTT：種96孔培養(yǎng)板，不同濃度碘離子及碘分子處理4、12、24、48小時(shí)后，每孔添加2μl(5mg/ml)MTT試劑，37℃孵育4小時(shí)，小心棄去培養(yǎng)液，每孔加入15μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10分鐘。以酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)下測(cè)其光吸收值(吸光度A值)，可間接反映細(xì)胞數(shù)量。 5．流式細(xì)胞術(shù)：不同濃度碘離子及碘分子處理細(xì)胞48小時(shí)，經(jīng)離心-PBS沖洗-吹勻-固定-再離心-沖洗-吹打-染色(4℃，20～

4、30分鐘)后，以400目尼龍網(wǎng)過(guò)濾后上機(jī)檢測(cè)。ModFit分析軟件分析，用細(xì)胞分裂增殖指數(shù)表示相對(duì)增殖活力。 6．免疫細(xì)胞化學(xué)：將潔凈無(wú)菌的蓋玻片放入6孔培養(yǎng)板中，制備單細(xì)胞懸液，種6孔板，以不同濃度的碘離子及碘分子處理48小時(shí)后取出蓋玻片，固定細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞中Ki-67的表達(dá)。 7．SOD、MDA檢測(cè)：利用試劑盒對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的上清液中丙二醛(MDA)和超氧化物岐化酶(SOD)進(jìn)行檢測(cè)。 【結(jié)果】 1．細(xì)胞

5、計(jì)數(shù)及MTT檢測(cè)：碘離子濃度及碘分子濃度較低(如48小時(shí)：碘離子≤3000μg/L，碘分子≤400μg/L)時(shí)，細(xì)胞計(jì)數(shù)隨濃度增加而增加，細(xì)胞活性也隨濃度增加而升高；碘離子濃度及碘分子濃度較高(如48小時(shí)：碘離子≥3000μg/L，碘分子≥400μg/L)時(shí)，細(xì)胞計(jì)數(shù)隨濃度增加而減少，細(xì)胞增殖活性也隨濃度增加而降低，且可見細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。 2．流式細(xì)胞術(shù)：碘離子濃度100～4000μg/L(碘分子濃度50～700μg/L)實(shí)驗(yàn)組

6、細(xì)胞增殖指數(shù)明顯高于對(duì)照組，同時(shí)細(xì)胞凋亡率明顯低于對(duì)照組；碘離子濃度5000μg/L(碘分子濃度800μg/L)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖指數(shù)與對(duì)照組比較沒(méi)有明顯差別，而細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組；碘離子濃度≥6000μg/L(碘分子濃度≥900μg/L)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖指數(shù)明顯低于對(duì)照組，同時(shí)細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組。 3．免疫細(xì)胞化學(xué)：碘離子濃度100～3000μg/L(碘分子濃度50-500μg/L)實(shí)驗(yàn)組Ki-67的陽(yáng)性率明顯高于對(duì)照組

7、；碘離子濃度≥5000μg/L(碘分子濃度≥700μg/L)各實(shí)驗(yàn)組Ki-67的表達(dá)率明顯低于對(duì)照組。 4．SOD、MDA檢測(cè)：碘離子濃度50～600μg/L(碘分子濃度50～300μg/L)實(shí)驗(yàn)組隨碘離子濃度的增加SOD含量增加，碘離子濃度800～10000μg/L(碘分子濃度600～4000Aμg/L)實(shí)驗(yàn)組隨碘離子濃度的增加SOD含量減少；碘離子濃度50～800μg/L(碘分子濃度50-500μg/L除200μg/L外)各

8、實(shí)驗(yàn)組MDA含量與對(duì)照組比較無(wú)明顯差別，碘離子濃度1000～10000μg/L(碘分子濃度700-400μg/L)各實(shí)驗(yàn)組MDA含量與對(duì)照組比較明顯高于對(duì)照組。 【結(jié)論】 1．碘對(duì)成纖維細(xì)胞增殖活性具有促進(jìn)和抑制兩方面的作用，其作用效果與作用時(shí)間作用濃度密切相關(guān)，即高碘對(duì)成纖維細(xì)胞增殖活性存在時(shí)間-劑量-效應(yīng)關(guān)系。 2．初步分析碘主要是通過(guò)對(duì)成纖維細(xì)胞氧化-抗氧化體系、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的調(diào)控來(lái)影響成纖維細(xì)胞增殖