1、D-苯丙氨酸是L-苯丙氨酸的手性對映體，與L-苯丙氨酸理化性質近似，僅旋光性相反，在醫(yī)藥、食品等領域具有廣泛的應用價值，D-苯丙氨酸屬于非蛋白型氨基酸，很難從天然產物中大量獲得。其目前的主要生產方法為化學合成法，成本很高，無法滿足D-苯丙氨酸逐漸升高的市場需求。因此，發(fā)展新的廉價的生產D-苯丙氨酸乃至D-氨基酸方法是目前國際上氨基酸領域的研究熱點。直接發(fā)酵法是L-苯丙氨酸的主要生產方法，其效率高、低成本、工藝流程簡單。但目前國內外仍無法

2、實現(xiàn)D-苯丙氨酸的直接發(fā)酵法生產，其最主要原因就是沒有性能良好的的D-苯丙氨酸生產菌株。
　　 本文以野生型大腸桿菌W3110為出發(fā)菌株，以構建D-苯丙氨酸基因工程菌株為目標，對大腸桿菌L-苯丙氨酸合成與分解代謝進行系統(tǒng)的研究和改造，并且構建了其本身不存在的D-苯丙氨酸合成模塊。通過無痕敲除等基因工程手段，初步構建了D-苯丙氨酸基因工程菌株。
　　 首先對大腸桿菌中存在的苯丙氨酸合成途徑進行改造，通過敲除鄰氨基苯甲酸合酶

3、基因(trpE)、分支酸變位酶基因(tyrA)，阻斷合成色氨酸、酪氨酸的合成支路；解除關鍵酶分支酸變位酶/預苯酸脫水酶基因(pheA)的反饋抑制，構建pheAfor基因和另一限速酶DAHP合酶基因aroF的表達質粒，獲得了基因工程菌株EC237。我們通過搖瓶發(fā)酵驗證EC237具有積累L-苯丙氨酸的能力，同時也表明上述基因工程改造可以有效的擴大L-苯丙氨酸的合成通路的代謝流；在EC237的基礎上，引入了來源于枯草芽胞桿菌W168的D-氨基

4、轉移酶，構建了D-苯丙氨酸生物合成途徑，通過敲除L-苯丙氨酸轉氨酶基因(aspC,tyrB)使苯丙酮酸得到有效積累，通過敲除D-苯丙氨酸分解酶的基因(dadA)阻斷D-苯丙氨酸的分解，最終構建了D-苯丙氨酸的初級基因工程菌EC238。經過48h的搖瓶發(fā)酵菌株EC238有2.35mmol/L的苯丙氨酸積累；在7.5L發(fā)酵罐上發(fā)酵48h，菌株有6mmol/L的苯丙氨酸積累，菌株的產酸能力與搖瓶發(fā)酵相比提高2.55倍，其中有0.5mmol/L