1、納米材料已愈來愈多地應(yīng)用于人類生活的方方面面,例如能源、環(huán)境、電子及生物醫(yī)學(xué)。納米材料的廣泛應(yīng)用使其在人類與自然環(huán)境中迅速滲透,而人們對(duì)其生物效應(yīng)卻知之甚少。隨著越來越多有關(guān)納米毒性的報(bào)道,人們對(duì)納米材料安全性的關(guān)注也逐漸被提上日程,其中的關(guān)鍵問題是了解納米材料的基本生物行為及其分子機(jī)制。本文立足于對(duì)幾種重要功能納米材料生物效應(yīng)的研究,通過多種物理、化學(xué)與生物學(xué)手段發(fā)現(xiàn)了功能納米材料的蛋白質(zhì)結(jié)合、細(xì)胞攝取和對(duì)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路影響的若干規(guī)

2、律。這些規(guī)律的發(fā)現(xiàn)為納米材料的生物效應(yīng)提供了理論解釋,闡明了納米材料生物行為的可能的機(jī)制和調(diào)控機(jī)理。這些發(fā)現(xiàn)同時(shí)也具有重要的應(yīng)用價(jià)值:它為有效降低納米材料毒性、提高生物相容性提供方法學(xué)參考,并為納米材料作為治療試劑提供了可能性。
　　 本文首先研究了納米顆粒與蛋白質(zhì)的結(jié)合。納米顆粒趨于結(jié)合蛋白質(zhì)的性質(zhì)決定了它在人類和動(dòng)物體內(nèi)的毒性以及自身被免疫系統(tǒng)調(diào)理和清除的命運(yùn)。在該項(xiàng)工作中,通過改變多壁碳納米管(MWCNT)的直徑、表面化學(xué)

3、以及蛋白質(zhì)種類,借助穩(wěn)態(tài)熒光光譜、時(shí)間分辨熒光光譜和圓二色光譜等分析方法,研究了MWCNT與蛋白質(zhì)結(jié)合的機(jī)制。在對(duì)不同直徑(40 nm與10 nm)MWCNT的研究中發(fā)現(xiàn),直徑較大的具有更強(qiáng)的結(jié)合蛋白質(zhì)的能力。這個(gè)現(xiàn)象說明納米顆粒的表面曲率在其與蛋白質(zhì)結(jié)合過程中起到了關(guān)鍵作用。此外,碳納米管(CNT)的表面電荷和空間位阻也參與調(diào)節(jié)其與蛋白質(zhì)的結(jié)合,說明了CNT與蛋白質(zhì)雙方的電荷和立體化學(xué)性質(zhì)都對(duì)它們之間的結(jié)合產(chǎn)生了影響。另外,盡管蛋白質(zhì)

4、的自身熒光由于與CNT的結(jié)合而發(fā)生了淬滅,而其熒光壽命并沒有改變,說明這種熒光淬滅是由于形成復(fù)合物而發(fā)生的穩(wěn)態(tài)淬滅。通過圓二色譜法研究蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)發(fā)現(xiàn),蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)受到了其與CNT結(jié)合的影響,因此可能會(huì)影響蛋白質(zhì)的生物功能。
　　 當(dāng)CNT與細(xì)胞表面受體或細(xì)胞內(nèi)蛋白相互作用時(shí),將會(huì)影響細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)通路。因此評(píng)估其細(xì)胞攝取和細(xì)胞內(nèi)定位對(duì)了解其生物效應(yīng)的機(jī)制是必不可少的。目前已知CNT可以非常容易地穿過各種各樣的生物學(xué)屏障

5、而進(jìn)入多種有機(jī)體,包括動(dòng)物、植物及微生物,然而對(duì)其細(xì)胞攝取的機(jī)制和進(jìn)入細(xì)胞后的轉(zhuǎn)運(yùn)并不完全清楚。目前對(duì)CNT的細(xì)胞攝取、細(xì)胞內(nèi)定位和轉(zhuǎn)移機(jī)制尚存爭(zhēng)議。為了闡明細(xì)胞攝取的機(jī)制,我們利用透射電子顯微鏡對(duì)表面帶電荷的MWCNT的細(xì)胞攝取進(jìn)行了超微結(jié)構(gòu)的觀察,發(fā)現(xiàn)了MWCNT的直接穿膜、內(nèi)吞、內(nèi)吞體泄露和細(xì)胞核定位等現(xiàn)象。我們結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道和自己的實(shí)驗(yàn)觀察,推出了一個(gè)細(xì)胞攝取模型。在該模型中,將MWCNT分為兩組,一組是凝聚態(tài)的CNT團(tuán)簇,另一組

6、是單個(gè)分散的CNT。團(tuán)簇通過能量依賴性的內(nèi)吞過程進(jìn)入細(xì)胞并首先進(jìn)入內(nèi)吞體；內(nèi)吞體內(nèi)的團(tuán)簇隨后變得疏松,使單根CNT釋放出來,釋放出來的單根CNT穿過內(nèi)吞體膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)；高度分散的單個(gè)CNT通過直接穿膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)；短CNT有可能進(jìn)入細(xì)胞核；最后,所有種類的CNT都進(jìn)入溶酶體并排出細(xì)胞。該模型將會(huì)對(duì)CNT的藥物傳遞和毒性研究產(chǎn)生重要影響。例如,基于此模型,細(xì)胞內(nèi)的CNT都有可能進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)并與其中的功能性分子發(fā)生未知的作用,從而造成某些細(xì)胞機(jī)

7、能的缺失。
　　 CNT進(jìn)入細(xì)胞后,將不可避免地與細(xì)胞內(nèi)組分發(fā)生相互作用并產(chǎn)生時(shí)間和劑量依賴性的細(xì)胞反應(yīng)。我們利用一個(gè)新型實(shí)時(shí)細(xì)胞電子傳感技術(shù)動(dòng)態(tài)地監(jiān)控了CNT的細(xì)胞反應(yīng)。這項(xiàng)技術(shù)利用整合在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板底部的電子傳感器對(duì)貼附在其上的細(xì)胞進(jìn)行電阻測(cè)量,并通過換算得出反應(yīng)細(xì)胞多項(xiàng)指標(biāo)的參數(shù)(細(xì)胞指數(shù)),細(xì)胞指數(shù)反應(yīng)了細(xì)胞增殖、細(xì)胞形態(tài)、貼附及延展。這種技術(shù)無須生物標(biāo)記、實(shí)時(shí)并且可以高通量的進(jìn)行測(cè)試,克服了目前對(duì)于CNT細(xì)胞效應(yīng)研

8、究中基于光度測(cè)量的諸多缺點(diǎn),并使CNT細(xì)胞反應(yīng)的動(dòng)態(tài)監(jiān)控成為可能。利用該手段我們獲得了動(dòng)態(tài)細(xì)胞反應(yīng)曲線、時(shí)間依賴性IC50及細(xì)胞生長曲線的斜率等參數(shù)。這些參數(shù)是無法用傳統(tǒng)方法獲得的,為CNT及多種納米材料的生物效應(yīng)研究提供了重要信息。
　　 由于CNT自身可以與蛋白發(fā)生相互作用、進(jìn)入細(xì)胞并造成動(dòng)態(tài)的細(xì)胞反應(yīng),因此,了解其細(xì)胞內(nèi)行為的分子機(jī)制是亟待解決的問題。這些問題包括哪些信號(hào)通路受到了影響、哪些基因的表達(dá)發(fā)生了改變及其后續(xù)的生

9、理效應(yīng)是怎樣的。我們通過對(duì)羧基化單壁碳納米管(SWCNT-COOH)的動(dòng)態(tài)細(xì)胞反應(yīng)的監(jiān)控、全基因組表達(dá)分析和其他細(xì)胞生物學(xué)手段,發(fā)現(xiàn)它可以通過一種非凋亡的機(jī)制抑制細(xì)胞增殖。該機(jī)制與目前研究報(bào)道中未修飾碳管的效應(yīng)是截然不同的。基于SWCNT-COOH對(duì)細(xì)胞增殖、基因和蛋白質(zhì)表達(dá)及蛋白質(zhì)磷酸化的影響,我們得出
　　 結(jié)論:該CNT抑制了Smad依賴性的骨形態(tài)發(fā)生蛋白信號(hào)傳導(dǎo)通路并下調(diào)Id蛋白的表達(dá)。這些分子行為造成了細(xì)胞周期G1/S

10、過渡期的停滯和細(xì)胞增殖的抑制。SWCNT-COOH對(duì)該信號(hào)通路及基因表達(dá)的抑制表明了功能化CNT對(duì)人類細(xì)胞具有非凋亡效應(yīng)。這個(gè)發(fā)現(xiàn)同樣對(duì)人類疾病的治療具有潛在的價(jià)值,例如與骨形態(tài)發(fā)生蛋白信號(hào)通路相關(guān)(骨科疾病)或與Id蛋白相關(guān)(乳腺癌)的疾病。
　　 盡管目前對(duì)納米顆粒/蛋白質(zhì)結(jié)合以及納米顆粒的細(xì)胞毒性研究都有分別報(bào)道,卻沒有關(guān)于納米顆粒/蛋白質(zhì)團(tuán)簇形成與納米顆粒細(xì)胞攝取和動(dòng)態(tài)細(xì)胞效應(yīng)之間關(guān)系的研究。本課題研究并發(fā)現(xiàn)不同粒徑和表

11、面化學(xué)修飾的磁性納米顆?？梢越Y(jié)合不同種類和數(shù)量的蛋白質(zhì)而不影響蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)。羧基化磁性納米顆粒具有較高的細(xì)胞毒性,而PEG的修飾則降低了它們的細(xì)胞攝取和毒性。與較大粒徑材料相比,小粒徑磁性納米顆粒(羧基尤為嚴(yán)重)能夠結(jié)合更多的血清蛋白,進(jìn)入細(xì)胞較少,但是卻造成更強(qiáng)的動(dòng)態(tài)細(xì)胞反應(yīng)。因而我們得出結(jié)論:對(duì)于水溶性磁性納米顆粒,除了其自身粒徑和表面電荷的影響外,納米/蛋白團(tuán)簇的細(xì)胞效應(yīng)還受吸附蛋白種類和數(shù)量的影響,并且與蛋白質(zhì)構(gòu)象變化無關(guān)。<

12、br>　　 納米技術(shù)的迅速發(fā)展,尤其是新型納米結(jié)構(gòu)的不斷涌現(xiàn),需要我們首先對(duì)其生物學(xué)效應(yīng)進(jìn)行評(píng)估。在論文的最后一部分,我們研究了一種新型功能化納米材料-核/殼-鐵/碳納米顆粒的細(xì)胞效應(yīng)。該材料是最新開發(fā)的具有磁共振成像、磁熱治療和藥物傳遞應(yīng)用前景的復(fù)合納米材料。但是目前對(duì)該材料與生物系統(tǒng)的相互作用并不清楚。為了闡明該材料潛在毒性及表面化學(xué)-生物相容性的關(guān)系,我們選擇幾種不同化學(xué)修飾的核/殼-鐵/碳納米顆粒,研究了它們的動(dòng)態(tài)細(xì)胞反應(yīng)、細(xì)