1、第一部分、大鼠小腸移植慢性排斥反應模型的建立及病理學比較
　　 目的：采用F344-Lewis大鼠組合初步建立大鼠小腸移植慢性排斥反應模型，觀測小腸組織慢性排斥病理表現(xiàn)。
　　 方法：利用顯微外科技術構建異系異位和異系原位大鼠小腸移植模型，術后0-14天給予皮下注射環(huán)孢素。術后90天進行移植物活檢，常規(guī)病理學檢測。乳果糖/甘露醇比值、D-木糖吸收實驗檢測移植腸功能。
　　 結果：（1）異位和原位小腸移植大鼠均能長

2、期存活，大部分超過90天。（2）異位小腸移植在術后90天出現(xiàn)典型的慢性排斥反應的病理學特征，包括粘膜結構改變、間質纖維化、白細胞浸潤和動脈內(nèi)膜增殖。（3）術后90天的原位移植小腸組織學形態(tài)相對正常。原位小腸移植大鼠在術后150天左右具有慢性排斥的病理組織學特征，但病變程度輕于術后90天的異位移植小腸。（4）大部分原位小腸移植大鼠在術后150天出現(xiàn)持續(xù)的體重下降，且不能被環(huán)孢素逆轉。當體重下降超過30％時，乳果糖/甘露醇比值和D-木糖吸收

3、實驗結果證實移植腸功能下降。
　　 結論：（1）異位小腸移植在術后90天出現(xiàn)典型的慢性排斥反應的病理學改變，而原位小腸移植在該時間點無慢性排斥反應改變。（2）原位小腸移植于術后150天左右出現(xiàn)慢性排斥改變，以持續(xù)性體重下降為臨床表現(xiàn)，并伴隨腸道吸收功能以及屏障功能的下降。（3）F344-Lewis異位小腸移植手術操作相對簡單，經(jīng)練習后手術成功率可達85％以上。（4）由于異位小腸移植可以出現(xiàn)典型的慢性排斥反應的組織病理學特征，故后

4、繼實驗采用F344-Lewis異位小腸移植模型，并根據(jù)組織病理學檢查結果確定術后90天為觀察終點。
　　 第二部分、大鼠異位小腸移植慢性排斥反應的研究
　　 目的：建立大鼠異位小腸移植模型并研究相關慢性排斥反應機理。
　　 方法：利用顯微外科技術構建同系和異系大鼠小腸移植模型，分為3組：同系移植組、異系移植組、異系治療組（給予環(huán)孢素）。分別在術后7天、14天、30天、60天、90天進行移植物活檢，常規(guī)病理學檢測，

5、建立小腸移植排斥反應組織學評分標準。應用Real time-PCR技術檢測移植物內(nèi)TGFβ1、PDGF、PDGF-CmRNA轉錄水平，采用免疫組織化學方法檢測CD68、TFGFβ1、PDGF-C表達情況。
　　 結果：（1）異系對照組全部大鼠均在術后15天內(nèi)死亡。（2）異系治療組自術后14天開始炎細胞浸潤程度病理評分顯著高于同期同系對照組，術后30天粘膜結構變化以及纖維化程度病理評分顯著高于同期對照組，術后60天動脈內(nèi)膜增殖開始

6、有顯著差異（3）CD68檢測提示在慢性排斥反應全程CD68的表達持續(xù)升高，術后60天達最高水平。（4）異系治療組的TGF-β1及PDGF-C mRNA轉錄水平和蛋白表達水平在第60天較同期的同系移植組顯著升高，免疫組化可見TFGF-β1在間質高表達，PDGF-C主要由組織細胞高表達于胞漿及胞膜。
　　 結論：（1）術后第60天環(huán)孢素組的單核巨噬細胞浸潤嚴重，同時伴TGFβ1、PDGF-C的高表達。（2）異系治療組術后60天即可出

7、現(xiàn)慢性排斥反應表現(xiàn)，并同時伴有CD68、TGFβ1、PDGF-C分子的顯著高表達，提示CD68、TGFβ1、PDGF-C對于判定慢性排斥反應具有指導意義。
　　 第三部分、大鼠骨髓間充質干細胞的體外分離培養(yǎng)與鑒定
　　 目的：建立穩(wěn)定的大鼠間充質干細胞的體外分離、培養(yǎng)、鑒定方法，為進一步開展研究MSCs對小腸移植慢性排斥反應的影響提供細胞來源。
　　 方法：選用1月齡清潔級Lewis大鼠，處死消毒后取其長骨，用P

8、BS緩沖液沖洗骨髓腔，收集沖洗液，采用密度梯度離心法分離獲取細胞，培養(yǎng)后取貼壁細胞進行傳代培養(yǎng)。取第3代生長狀態(tài)良好的細胞，0.25％胰蛋白酶-EDTA消化制成細胞懸液計數(shù)并記錄生長曲線。取第3、4、5代生長狀態(tài)良好細胞，以流式細胞術鑒定細胞表型。取第3代MSCs定向誘導分化成骨細胞，采用堿性磷酸酶染色、茜素紅染色進行成骨細胞鑒定。CFSE標記第3代MSCs并觀察標記效率。
　　 結果：（1）體外培養(yǎng)的原代MSCs72小時可見貼

9、壁細胞，3周左右可達到90％的融合，2代后即可得到較為純化的MSC成纖維樣細胞。（2）流式細胞儀檢測第3代MSCs表面標記物CD29、CD90的陽性率可達96％以上，CD34、CD45的陽性率低于3％。（3）堿性磷酸酶染色和茜素紅染色結果證實成骨細胞誘導成功。（4）用CFSE進行細胞標記后，熒光顯微鏡下見幾乎所有MSCs均已被標記綠色熒光，流式細胞儀檢測結果顯示標記比例達100％，提示CFSE標記效率高。
　　 結論：（1）MS

10、Cs是一類增殖能力旺盛，具有多向分化潛能的干細胞。（2）密度梯度離心聯(lián)合貼壁培養(yǎng)法是一種簡便易行的培養(yǎng)MSCs方法，操作簡單，成功率高，可以作為培養(yǎng)大鼠骨髓MSCs的常規(guī)方法。（3）CFSE標記可作為標記MSCs的一種有效手段。
　　 第四部分、大鼠骨髓間充質干細胞體外免疫抑制功能的實驗研究
　　 目的：探討骨髓間充質干細胞（MSCs）在混合淋巴細胞培養(yǎng)反應中對同種異體脾細胞免疫應答反應的影響，并初步探討其作用機制。

11、r>　　 方法：建立MSCs和同種異體脾細胞共培養(yǎng)體系，反應體系總量300ul，以刀豆蛋白A為刺激因素，CFSE標記部分反應細胞。共分4組：①脾細胞，②脾細胞+conA，③脾細胞+MSCs，④脾細胞+MSCs+conA，每組6復孔，每孔脾細胞數(shù)5×105個，MSCs為105個，ConA終濃度為10ug/ml?；旌吓囵B(yǎng)72小時后，于倒置熒光顯微鏡下觀察細胞增殖情況，流式細胞儀分析熒光強度以及CD4、CD8比例。
　　 結果：MS

12、Cs和脾細胞共培養(yǎng)組未見明顯的增殖子峰，其中CD4、CD8陽性細胞表達明顯下降，而CD4/CD8比值無明顯變化。
　　 結論：骨髓MSCs體外能夠抑制刀豆蛋白A引起的淋巴細胞增殖反應，對CD4T細胞、CD8T細胞均有抑制作用。
　　 第五部分、受體源骨髓間充質干細胞對大鼠異位小腸移植慢性排斥反應的影響
　　 目的：研究靜脈輸注受體骨髓間充質干細胞（MSCs）對大鼠異位小腸移植慢性排斥反應的影響及其機制。
　

13、　 方法：利用顯微外科技術構建異系小腸移植模型16只，隨機分為2組：對照組和MSCs輸注組。小腸移植后24小時，確定手術成功后，MSCs組自陰莖背靜脈輸注骨髓間充質干細胞107個（溶液為2ml生理鹽水），對照組給予同體積的生理鹽水，術后0～14天兩組均給予環(huán)孢素處理。觀察兩組移植大鼠術后生存狀態(tài)，于術后第60天全部剖殺獲取移植小腸。常規(guī)病理學檢測，進行慢性排斥反應病理評分。應用Realtime-PCR技術檢測移植物內(nèi)TGFβ1、PDG

14、F-CmRNA轉錄水平，采用免疫組織化學方法檢測CD68、TGFβ1、PDGF-C表達情況。另外再建立兩只大鼠異位小腸移植模型，給予環(huán)孢素處理，術后24小時給予陰莖背靜脈輸注標記了熒光CFSE的骨髓MSCs，術后7天剖殺獲取移植小腸以及自體其他組織器官備冰凍切片檢查以觀察MSCs在受體內(nèi)的定位。
　　 結果：（1）輸注的骨髓MSCs可特異的定向遷移至移植小腸。（2）術后60天MSCs組小腸標本的粘膜結構、炎細胞浸潤、纖維化程度和