1、人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(hGM-CSF)是一種酸性糖蛋白，含有127個氨基酸殘基，其重組蛋白rhGM-CSF可以在大腸桿菌、酵母、哺乳動物細胞中表達，rhGM-CSF分子量從14.4到32kDa不等。rhGM-CSF具有促進骨髓造血前體細胞增殖的作用，刺激粒細胞、單核細胞、巨噬細胞的集落形成和增生。該重組蛋白最初用于骨髓移植、腫瘤化療及艾滋病相關的中性粒細胞缺乏癥。目前，rhGM-CSF是以注射劑的形式應用于臨床，有一定的局限性以

2、及劑型引起的不良反應的風險。本實驗室利用家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)研制了重組人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(BmrhGM-CSF)口服膠囊，分子量為29kDa，臨床前研究表明BmrhGM-CSF在體內(nèi)外均具有生物學活性：在體外可以促進人骨髓干細胞集落形成；體內(nèi)試驗證明給小鼠、狗和獼猴灌胃BmrhGM-CSF后可以吸收入血并且發(fā)揮細胞因子的功能：(1)小鼠口服BmrhGM-CSF后，明顯促進脾臟表面造血灶的形成和骨髓DNA的合成；(2)60Co

3、輻照導致造血功能抑制的比格犬口服BmrhGM-CSF后第9天白細胞數(shù)目恢復到基值的50％，到第12天恢復到正常水平；(3)經(jīng)環(huán)磷酰胺化療的獼猴口服BmrhGM-CSF后，相對空白對照組，其白細胞的數(shù)量明顯增加，其療效與注射劑rhGM-CSF相似。
　　 基于上述工作的基礎，本論文開展以下兩部分研究：一是BmrhGM-CSF膠囊Ⅰ期臨床試驗，二是BmrhGM-CSF膠囊口服吸收機制的研究。一、BmrhGM-CSF膠囊Ⅰ期臨床試驗<

4、br>　　 為探索BmrhGM-CSF膠囊單劑量用藥安全性，選擇健康受試者27例，分成5個劑量組：150ug、300ug、600ug、750ug、900ug，口服給藥一次，按照劑量由低到高的順序安排試驗，試驗期間需觀察前一個劑量組不產(chǎn)生明顯的藥物不良反應，才進行下一個劑量組試驗。經(jīng)過臨床觀察以及尿液、血生化、心電圖等指標的檢查表明：BmrhGM-CSF膠囊單次用藥在900ug以下為安全劑量范圍，沒有發(fā)生與藥物相關的不良反應。
　

5、　 為研究BmrhGM-CSF膠囊藥效學，采取兩種試驗方案，一是選擇14例實施化療的腫瘤患者，分成2個劑量組：150μg和300μg，一天口服2次，連續(xù)14天，經(jīng)過實驗室檢查發(fā)現(xiàn)BmrhGM-CSF膠囊在上述兩個劑量下多次給藥后沒有發(fā)生與藥物相關的不良反應，而且口服BmrhGM-CSF膠囊后可以預防因化療導．致的白細胞和中性粒細胞下降。另外一種方案是將48例腫瘤放、化療病人隨機分成2組：口服BmrhGM-CSF膠囊組（39人）以及安慰

6、劑對照組（9人）；口服BmrhGM-CSF組于放化療后第三天口服BmrhGM-CSF:一次300μg，一天2次，連續(xù)12天；安慰劑對照組于放化療后第三天口服安慰劑：一次2粒，一天2次，連續(xù)12天。試驗發(fā)現(xiàn)：在安慰劑組，給藥后第3天白細胞和中性粒細胞均開始下降，到第9天白細胞數(shù)目下降到最低值為3.31×109/L、中性粒細胞數(shù)目為1.53×109/L;而在口服BmrhGM-CSF膠囊組，給藥后第9天白細胞數(shù)目和中性粒細胞數(shù)目分別為4.61

7、×109/L和2.32×109/L。上述結(jié)果表明口服BmrhGM-CSF膠囊能夠改善腫瘤病人因放化療引起的白細胞和中性粒細胞下降的癥狀。
　　 根據(jù)雙處理、雙周期、兩序列的隨機交叉試驗設計方法，選擇19例志愿者，口服BmrhGM-CSF8μg/kg或皮下注射大腸桿菌表達的rhGM-CSF3.75μg/kg，給藥后按Oh、0.5h、0.75h、1.0h、1.5h、2.0h、3.0h、4.0h、5.0h、6.0h、8.0h、10.0

8、h、12.0h肱靜脈取血，ELISA法測定血液中hGM-CSF濃度，結(jié)果表明19人口服BmrhGM-CSF后，有15人血液中檢測到與正常血漿有顯著差異的血藥濃度，用梯形面積法計算藥時曲線下面積AUC，根據(jù)試驗品的AUC與參比品的AUC比值計算相對生物利用度得出BmrhGM-CSF經(jīng)口服后在15人中有效吸收的平均生物利用度為1％，最高為3.1％。二、BmrhGM-CSF膠囊口服吸收機制的研究
　　 BmrhGM-CSF經(jīng)125Ⅰ標

9、記后，按10μg/kg、50μg/kg的劑量給ICR小鼠灌胃，給藥后在不同的時間收集尿液檢測放射活性，結(jié)果表明，口服125Ⅰ-BmrhGM-CSF8h后，經(jīng)尿液排出大約18％的125Ⅰ總放射活性。同時在口服125Ⅰ-BmrhGM-CSF30min后采血，離心析出血清，SDS-PAGE電泳后放射自顯影，在高劑量組(50ug/kg)出現(xiàn)一條有125Ⅰ放射性的條帶，大小約18～20 kDa，這條帶為125Ⅰ-BmrhGM-CSF的部分降解產(chǎn)物

10、，低劑量組沒有出現(xiàn)125Ⅰ放射性的條帶，說明125Ⅰ-BmrhGM-CSF可以吸收入血。
　　 SD大鼠灌胃50μg/kg,10μg/kg的BmrhGM-CSF，給藥后15min在大鼠血清中可檢測到GM-CSF。兩組大鼠在給藥后30min時內(nèi)血清中GM-CSF濃度達到最高值分別是1010ng/L、212ng/L，然后逐漸下降，一直維持到12h，12h后所有大鼠血漿中均無法測出GM-CSF。說明SD大鼠口服BmrhGM-CSF膠囊

11、后可以被吸收入血。
　　 設計自身交叉試驗，取3名志愿者口服BmrhGM-CSF或注射rhGM-CSF后Oh，lh，2h，3h，4h后的血清樣品進行質(zhì)譜分析(Q-Trap MS/MS TOF)，對各取樣點進行EMS掃描，得出各點的一級譜圖，以Oh為參照點，其它點分別與之比較，得出差異峰，對差異峰進行EPI掃描，進而得出此差異峰的分子量及其可能的氨基酸序列。以Oh的血清樣本的MS數(shù)據(jù)為對照，在其余不同時間EM峰中找出差異峰，并對這

12、些差異峰作進一步分析。根據(jù)分子量建立的肽圖譜表明，在差異峰中存在hGM-CSF肽片段，這些大小不同的多肽分子量范圍是2039到7336Da，證明通過口服，BmrhGM-CSF可以經(jīng)腸道吸收進入血液。
　　 將蠶蛹凍干粉與大腸桿菌表達的rhGM-CSF混合給小鼠灌胃，結(jié)果證明小鼠灌胃這種混合物后其血液中rhGM-CSF濃度升高。將蠶蛹勻漿，離心除去沉淀，將上層溶液置于分液漏斗，分離富脂蛋白層和蛋白質(zhì)層，制成凍干粉，分別作為載藥材料

13、包裹大腸桿菌表達的rhGM-CSF并且給小鼠灌胃。試驗結(jié)果表明將蠶蛹富脂蛋白層作為載藥材料包裹rhGM-CSF給小鼠灌胃后30min和60min的血藥濃度顯著上升，分別為98.73ng/L、106.28ng/L。將蠶蛹蛋白層作為載藥材料包裹rhGM-CSF給小鼠灌胃后30min和60min的血藥濃度也會上升，分別為48.73ng/L、76.25ng/L，說明蠶蛹富脂蛋白層和蛋白質(zhì)層均可以促進rhGM-CSF的口服吸收，而且蠶蛹富脂蛋白層

14、作為載藥材料包裹rhGM-CSF的效果比蠶蛹蛋白層的要好。
　　 將大腸桿菌表達的rhGM-CSF用蠶蛹富脂蛋白層包裹后給小鼠灌胃后取血清，用快速液相色譜(FPLC)的10 RI反相柱進一步純化血清樣品的蛋白質(zhì)，按峰自動收集，再利用MALDI-TOF MS進行質(zhì)譜分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)口服rhGM-CSF的小鼠血清中存在14.5kDa的rhGM-CSF，其質(zhì)譜圖類似于皮下注射大腸桿菌表達的rhGM-CSF的小鼠血清質(zhì)譜圖。另外，用5％戊

15、二醛固定蠶蛹富脂蛋白層承載的rhGM-CSF于銅臺上，在掃描電子顯微鏡下觀察到蠶蛹富脂蛋白層包裹的rhGM-CSF樣品形成近似球形的微囊結(jié)構(gòu)，這種脂質(zhì)微囊具有脂溶性，它可能與小腸壁絨膜細胞膜融合，通過胞飲作用將rhGM-CSF微囊球通過生物膜內(nèi)陷形成細胞吞噬體而進入細胞內(nèi)，繼而將rhGM-CSF從小腸壁外轉(zhuǎn)運到小腸壁內(nèi)。
　　 將蠶蛹蛋白通過Sephadex G-150分離柱的分離純化，我們收集到36管蛋白樣品。應用Biaeor