1、本文在馴化選育一株馬克斯克魯維酵母K.marxianus YX01的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了同步糖化發(fā)酵菊粉和菊芋粗原料生產(chǎn)乙醇的研究工作。 通過正交實(shí)驗(yàn)法對(duì)該菌株產(chǎn)菊粉酶培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件進(jìn)行了研究，確定培養(yǎng)基組成為(g/L)：菊粉40，酵母粉4，蛋白胨4，尿素1；在初始pH值5.0，溫度30℃，轉(zhuǎn)速150 rpm/min條件下培養(yǎng)菊粉酶活性達(dá)到57 U/mL。以菊粉為底物，該酶的最適水解溫度為55℃，在60℃以下穩(wěn)定性好；最適pH值

2、為5.0，在pH4.6-5.2范圍內(nèi)酶穩(wěn)定性好；該酶屬于外切菊粉酶，8％的乙醇對(duì)其酶活力基本沒有影響。 K.marxianus YX01的種子液的培養(yǎng)時(shí)間為24 h，培養(yǎng)基初始pH最適為4.6，最適發(fā)酵溫度為35℃；在通氣量為50 ml/min和100 ml/min時(shí)菌體生長速度加快，發(fā)酵時(shí)間縮短，但不通氣條件下糖醇轉(zhuǎn)化率明顯提高；在菊粉濃度235 g/L時(shí)，發(fā)酵終點(diǎn)乙醇濃度達(dá)到92.2 g/L，乙醇對(duì)糖的得率為0.436，為

3、理論值的85.5％。 不同濃度海水灌溉的菊芋都是乙醇發(fā)酵的良好底物，尤其以25％海水灌溉的為最好。粉碎粒度為40-80目范圍內(nèi)，對(duì)發(fā)酵沒有明顯影響。濃度分別為200、225和250g/L的25％海水灌溉的菊芋干粉乙醇發(fā)酵結(jié)果表明，底物濃度越高，發(fā)酵液黏度越大，混和程度越差。在底物濃度為200 g/L時(shí)，乙醇得率為0.439。進(jìn)行批式補(bǔ)料發(fā)酵，將菊芋干粉濃度提高到280 g/L，發(fā)酵終點(diǎn)乙醇濃度達(dá)到83.75 g/L，為理論轉(zhuǎn)化率

4、的84.56％。 采用有機(jī)酸色譜柱Aminex HPX-87H，以0.01 mol/L硫酸水溶液為流動(dòng)相，流速為0.5ml/min，利用紫外和示差折光檢測(cè)器為雙通道檢測(cè)手段，同時(shí)對(duì)K.marxianus YX01菊芋發(fā)酵液中的葡萄糖、丙酮酸、果糖、琥珀酸、乳酸、甘油、乙酸、乙醇進(jìn)行了定量分析，發(fā)現(xiàn)主要的副產(chǎn)物為乳酸、甘油、乙酸，構(gòu)建了乙醇的代謝網(wǎng)絡(luò)。 利用兼并引物，通過降落PCR法克隆了K.marxianus YX01的

5、乳酸脫氫酶基因(LDH)片段，通過插入G418抗性基因構(gòu)建基因破壞載體，利用同源重組對(duì)LDH基因進(jìn)行了基因破壞。在生長條件下，破壞子T4乳酸脫氫酶活力在120h時(shí)比出發(fā)菌株降低了25％；在發(fā)酵條件下發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)乳酸脫氫酶降低46％；乙醇、甘油、乙酸和乳酸的終濃度都出現(xiàn)不同程度的降低，但琥珀酸的濃度出現(xiàn)一定程度的提高。與出發(fā)菌株相比，破壞子的生長受到一定抑制，菊粉酶活力下降20-30％。破壞子T4單位質(zhì)量細(xì)胞的乙醇產(chǎn)量反而提高，由對(duì)照菌株的