1、研究背景：股骨頭壞死(Osteonecrosis of the femoral head,ONFH)是由不同原因?qū)е碌墓晒穷^骨髓造血細胞、骨髓脂肪細胞及骨細胞變性壞死的一種疾病,為骨科臨床常見病之一。主要分為創(chuàng)傷性(traumatic osteonecrosis of femoralhaead TONFH)和非創(chuàng)傷性股骨頭壞死(non-traumatic osteonecrosis of femoralhead,NONFH)兩大類。有資

2、料表明股骨頭缺血性壞死已取代了原髖關節(jié)結(jié)核的位置,居髖關節(jié)疾病的首位。股骨頭壞死病因復雜,病程緩慢,治療困難,致殘率高,是長期以來困擾國內(nèi)外學者的醫(yī)學難題,有“不死的癌癥”之稱。而目前臨床上由于缺乏有效的早期篩查和檢測手段,很少能在股骨頭壞死早期發(fā)現(xiàn)從而進行藥物或手術(shù)干預,因此大多數(shù)患者直到出現(xiàn)疼痛,活動受限才來就診,此時多是處于股骨頭塌陷變形、骨性關節(jié)炎等病變晚期,只能施行人工髖關節(jié)置換手術(shù),最終導致患者生活質(zhì)量下降以及國家家庭個人的

3、經(jīng)濟負擔增加。因此,明確股骨頭壞死的原因,弄清其發(fā)病機制,尋找有價值的生物學標志物(biomarker),以期早期篩查發(fā)現(xiàn)股骨頭壞死并進行早期治療,是臨床和實驗室專家一直努力研究的方向。
　　 創(chuàng)傷性股骨頭壞死病因比較明確,但非創(chuàng)傷性股骨頭壞死確切病因和發(fā)病機制仍存在眾多爭論。目前激素性和酒精性股骨頭缺血性壞死仍被普遍認為是非創(chuàng)傷性股骨頭缺血性壞死最常見的原因。研究者們相繼提出了10多種學說,有脂肪代謝紊亂、血管內(nèi)凝血、微血管損

4、傷等。10余種學說所涉及多種酶類、細胞因子等,它們都是蛋白質(zhì)。眾所周知,蛋白質(zhì)是正常生理活動和疾病發(fā)生發(fā)展過程的執(zhí)行者和參與者。以往對蛋白質(zhì)的研究只是針對生命活動中某一或某幾種蛋白質(zhì),難以從整體、系統(tǒng)上闡明生命活動的基本機制。因此,大規(guī)模、全方位的蛋白質(zhì)研究勢在必行。
　　 蛋白質(zhì)組學(Proteomics)是從整體水平上研究蛋白質(zhì)表達、組成及活動規(guī)律的學科。其研究內(nèi)容主要包括三個部分:表達蛋白質(zhì)組學(ExpressionPro

5、teomics)、結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(Structural Proteomics)和功能蛋白質(zhì)組學(Functional Proteomics)。表達蛋白質(zhì)組學是指對一個指定的細胞、組織或生物所產(chǎn)生全部蛋白質(zhì)的鑒定。結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學是指對上述全部蛋白質(zhì)一級和三維結(jié)構(gòu)的測定。功能蛋白質(zhì)組學則是闡明蛋白質(zhì)的生理功能以及機體在不同時期中蛋白質(zhì)表達水平的動態(tài)變化。蛋白組學的研究可以實現(xiàn)與基因組的對接與確認,直接揭示人類重大疾病發(fā)生與發(fā)展的病理機制。<

6、br>　　 蛋白質(zhì)組學在大多數(shù)骨科疾病的研究方面還處于初步階段。近年來關于股骨頭壞死的蛋白質(zhì)組學研究多集中在患者的血清學和實驗動物骨組織方面的研究。少數(shù)幾項血清蛋白質(zhì)組學的研究也已發(fā)現(xiàn)多種蛋白的高表達與股骨頭缺血性壞死密切相關。但存在的問題是:血清蛋白質(zhì)成分不穩(wěn)定,極易受機體內(nèi)外環(huán)境的背景干擾,實驗數(shù)據(jù)重復性較差；動物實驗的數(shù)據(jù)和人體存在一定差異。這些蛋白質(zhì)組學研究大多基于常規(guī)雙向凝膠電泳(2-DE)技術(shù),存在一定的局限性:①上樣量的

7、限制使低豐度蛋白質(zhì)(<1 ng)難以檢測；②電泳結(jié)果需染色處理,而不同的蛋白質(zhì)與染料結(jié)合的差異較大；③目前尚不能全自動處理,耗時長,不能進行高通量分析。
　　 熒光差異凝膠電泳(difference gel electrophoresis,DIGE)技術(shù)由于繼承了二維凝膠電泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)的高分辨率,同時又具備高重現(xiàn)性、高靈敏度、高通量和高動態(tài)范圍等優(yōu)勢,使得DIGE

8、日益受到關注,成為目前最受歡迎的定量蛋白質(zhì)組學研究手段之一。
　　 骨組織蛋白的提取主要有化學法和物理法兩大類。幾項人體和動物實驗的骨組織蛋白質(zhì)組學的研究采取的是化學方法,雖然該法能夠從多種骨組織中分離出蛋白質(zhì)并將低豐度蛋白有效地鑒別出來,但耗時較長,約需一周時間,容易導致蛋白的分解變性,不適合做后續(xù)的Western blot研究。2009年王簕等應用錘擊研磨法提取骨組織蛋白,簡便易行,不破壞蛋白質(zhì)的構(gòu)成和理化性質(zhì),值得借鑒。<

9、br>　　 目的：探討非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的發(fā)病機制,為篩選可能生物學標志物和分子靶向治療提供理論依據(jù)。
　　 方法：本研究共分四個部分。第一部分,骨組織樣本的收集。臨床上經(jīng)影像學和病理確診的非創(chuàng)傷性股骨頭壞死實行髖關節(jié)置換術(shù)的患者,取壞死股骨頭骨組織,修剪成骨粒狀,置于-80℃冰箱備用,以新鮮股骨頸骨折患者的股骨頭骨組織為對照。第二部分,建立骨組織的熒光差異雙向電泳圖譜。使用液氮研磨法提取骨組織總蛋白,利用熒光差異凝膠電泳(D

10、IGE)技術(shù)分離蛋白質(zhì),掃描分析建立圖譜,尋找差異蛋白。第三部分,明顯差異蛋白質(zhì)的鑒定和生物信息學分析。挖取差異表達2倍以上的蛋白質(zhì),行基質(zhì)輔助激光解析離子化-飛行時間/飛行時間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF/TOF)鑒定,數(shù)據(jù)庫檢索,獲得這些蛋白質(zhì)的序列、結(jié)構(gòu)和功能信息,結(jié)合文獻,對感興趣蛋白行生物信息學分析。第四部分,差異蛋白的Western blot驗證。選取載脂蛋白A1和ATP合成酶(ATP5β),運用蛋白免疫印跡(Western

11、blot)技術(shù),再次行蛋白質(zhì)定量分析,驗證DIGE結(jié)果的可靠性。
　　 結(jié)果：通過DIGE成功分離1600±50個蛋白質(zhì)點,明顯差異蛋白點274個,利用EttanTM Spot picker自動工作站挖取表達差異達2倍以上的明顯差異蛋白點50個,利用MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀對這些差異蛋白點進行蛋白質(zhì)鑒定,共鑒定出9種蛋白質(zhì),分別是載脂蛋白A1(APOA1)、熱休克蛋白β-1(HSPβ-1)、ATP合成酶β亞基(ATP5β

12、)、纖維蛋白原γ鏈(FGG)、纖維蛋白原β鏈(FGB)、血清白蛋白(ALB)、硫氧蛋白過氧化物還原酶(PRDX2)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(TF)、肌動蛋白(ACTG1),除纖維蛋白原表達有下調(diào)外,其余蛋白均表達上調(diào)。通過多種數(shù)據(jù)庫查詢,這些蛋白分別涉及參與蛋白質(zhì)和脂質(zhì)代謝、能量代謝、細胞骨架、信號轉(zhuǎn)導、氧化還原等方面的功能,并進行亞細胞定位、相互作用等生物學信息學分析。選取載脂蛋白A1(APOA1)和ATP合成酶(ATP5β)做Westernblo

13、t,結(jié)果與DIGE結(jié)果相符。
　　 結(jié)論:
　　 1.使用液氮研磨提取骨組織總蛋白的物理方法,簡便有效,可以滿足后續(xù)的蛋白質(zhì)組學研究,對蛋白質(zhì)圖譜影響小。
　　 2.運用熒光差異雙向凝膠電泳(DIGE)可以高效分離骨組織蛋白質(zhì)組,獲得股骨頭壞死的差異蛋白質(zhì)表達譜。
　　 3.通過對差異表達的蛋白質(zhì)進行MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜分析鑒定,獲得了9種蛋白質(zhì),通過生物學信息學分析,這些蛋白質(zhì)可能與股骨頭壞死

14、的發(fā)生、發(fā)展有關,為篩選用于診斷的生物學標志物、為該疾病的分子靶向治療提供理論依據(jù)。
　　 4.通過Western blot對載脂蛋白A1和ATP合成酶表達量進行驗證,結(jié)果和DIGE結(jié)果一致,證明了以上研究的準確性和可靠性。
　　 創(chuàng)新點:經(jīng)國內(nèi)外文獻檢索,使用DIGE和MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜技術(shù)方法對非創(chuàng)傷性股骨頭壞死患者股骨頭骨組織進行蛋白組學分析的研究,未見報道。本研究直接采集股骨頭壞死患者的壞死股骨頭骨組