1、蛋白質(zhì)是生理功能的執(zhí)行者，對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的研究是生命科學(xué)研究中的熱點(diǎn)。激酶催化下的磷酸化修飾涉及細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、肌肉收縮、神經(jīng)活動(dòng)以及細(xì)胞的增值、發(fā)育和分化等生理病理過(guò)程。磷酸化的異常以及激酶的過(guò)度表達(dá)往往與許多重大疾病有關(guān)，如癌癥、糖尿病和老年癡呆癥。目前對(duì)蛋白激酶活性的傳感研究不多，方法局限，因此開(kāi)發(fā)檢測(cè)蛋白激酶新方法和篩選抑制劑用于臨床治療亟不可待。
　　 另一方面，研究氧化還原蛋白質(zhì)在電極界面的直接電子傳遞對(duì)理解他們?cè)?/p>

2、生物體內(nèi)電子轉(zhuǎn)移機(jī)制和生理作用具有重要意義。然而蛋白質(zhì)的活性中心深埋在內(nèi)部，很難實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的直接電化學(xué)。為了實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)可逆的電化學(xué)行為，探索電子傳遞的促進(jìn)劑是大家關(guān)注的焦點(diǎn)。
　　 基于以上考慮，綜合文獻(xiàn)報(bào)道，本論文利用不同納米材料(納米金、量子點(diǎn)、石墨烯等)的獨(dú)特性質(zhì)，開(kāi)發(fā)出多種無(wú)標(biāo)記快速蛋白激酶活性檢測(cè)方法。另外，將玻碳、碳納米管進(jìn)行電化學(xué)陰極處理，實(shí)現(xiàn)了氧化還原酶的直接電化學(xué)。具體細(xì)節(jié)如下：
　　 (1)構(gòu)建了一種

3、基于未修飾CdTe量子點(diǎn)聚集行為的無(wú)標(biāo)記熒光分析方法用來(lái)檢測(cè)蛋白激酶活性及其抑制作用。帶正電的底物多肽引起表面帶負(fù)電荷的CdTe量子點(diǎn)有選擇性的聚集。激酶催化底物多肽磷酸化，由于磷酸基團(tuán)的引入，改變了多肽的電荷，阻礙了量子點(diǎn)的聚集，引起熒光信號(hào)加強(qiáng)、發(fā)射波長(zhǎng)有45nm藍(lán)移，且熒光發(fā)生由黃到綠的顏色變化。因此，熒光強(qiáng)度及其顏色的響應(yīng)，使得這種基于量子點(diǎn)聚集的熒光分析法可以通過(guò)光譜儀甚至肉眼較容易地檢測(cè)到蛋白激酶活性。對(duì)蛋白激酶PKA的檢測(cè)

4、有較低的檢測(cè)限(0.47 mUμL-1)，其高靈敏檢測(cè)證實(shí)了該方法在開(kāi)發(fā)蛋白激酶活性分析方法上的可行性?；诹孔狱c(diǎn)的熒光響應(yīng)，估算得出的PKA的抑制劑H-89的IC50值為138 nM，與文獻(xiàn)值相當(dāng)。此外，該方法可以用來(lái)檢測(cè)在Forskolin/IBMX激活的細(xì)胞裂解液中的PKA。本方法相對(duì)于以往的激酶活性檢測(cè)方法相比，不需要多肽標(biāo)記和量子點(diǎn)修飾，為實(shí)現(xiàn)高效低耗檢測(cè)激酶活性和抑制劑的篩選提供可能。
　　 (2)設(shè)計(jì)了一種用于檢測(cè)

5、蛋白激酶活性及抑制劑的Label-free型電化學(xué)方法，即利用Zr4+與磷酸基的穩(wěn)定交聯(lián)，將DNA修飾的金納米粒子(DNA-AuNPs)與磷酸化多肽交聯(lián)。由于DNA-AuNPs帶大量負(fù)電荷，電活性物質(zhì)[Ru(NH3)6]3+分子便能定量地吸附在磷酸化位點(diǎn)上，因此可以通過(guò)[Ru(NH3)6]3+的信號(hào)采用電化學(xué)計(jì)時(shí)電量法檢測(cè)蛋白激酶的活性。抑制劑H-89對(duì)于PKA的IC50值估算為33 nM，與文獻(xiàn)報(bào)道相近。
　　 (3)介紹了一

6、種基于壓電石英晶體微天平(QCM)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)適配體多肽與蛋白激酶相互作用的、新穎的、一步法快速檢測(cè)蛋白激酶的方法。以PKA為例，將IP20作為適配體多肽通過(guò)組氨酸標(biāo)簽(His6-tag)與金屬離子的螯合作用，相同取向地固定在壓電石英晶體金電極表面，這一多肽組裝方法避免了蛋白的非特異性吸附。QCM對(duì)蛋白激酶結(jié)合上IP20表面的靈敏頻率響應(yīng)，使得我們能實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)蛋白激酶，并且能定量分析蛋白激酶PKA的濃度。與之前報(bào)道方法不一樣的是，適配體多肽與

7、蛋白激酶之間的識(shí)別不涉及激酶催化的磷酸化過(guò)程，因此監(jiān)測(cè)快速無(wú)需標(biāo)記，也不需要設(shè)計(jì)信號(hào)輸出機(jī)制獲得最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以實(shí)現(xiàn)蛋白激酶的一步法檢測(cè)(時(shí)間不超過(guò)10 min)。這一新方法同樣可用于在細(xì)胞裂解液中分析PKA催化亞基的含量。
　　 (4)首次提出了一種基于石墨烯/多肽復(fù)合物和羧肽酶降解作用的激酶活性分析方法。FITC標(biāo)記的CKII底物多肽FITC-peptide(FITC-RRRADDSDDDDD)，能與GO發(fā)生有效的熒光淬滅

8、。羧肽酶CPY能作用于任何一個(gè)C-末端殘基，從肽鏈的C端開(kāi)始逐個(gè)降解，釋放出游離氨基酸。FITC-peptide在CPY的消化作用下釋放出游離的FITC分子，在高離子強(qiáng)度環(huán)境下，游離FITC分子與GO之間的吸附較小而保持相當(dāng)強(qiáng)的熒光。而當(dāng)FITC-peptide在CKII/ATP催化發(fā)生磷酸化，有效地阻礙CPY在磷酸化絲氨酸位點(diǎn)的降解，使得FITC-多肽更容易與GO結(jié)合而導(dǎo)致熒光淬滅。因此根據(jù)熒光強(qiáng)度的變化可以檢測(cè)蛋白激酶的活性。這種由

9、蛋白激酶催化磷酸化誘導(dǎo)的多肽/GO復(fù)合物熒光強(qiáng)度的變化，有望為高通量檢測(cè)蛋白激酶活性及其篩選抑制劑提供新的思路。
　　 (5)在含0.05 M四丁基溴化銨(TBAB)的二甲亞砜(DMF)溶液中，用電化學(xué)循環(huán)伏安法可以得到表面納米化玻碳(SNGC)電極，玻碳電極表面的含碳微粒的粒徑分布在10-40 nm之間。相對(duì)于普通的玻碳電極，表面納米化玻碳電極對(duì)葡萄糖氧化酶GOD的直接電化學(xué)有更高的催化活性，原因在于SNGC電極表面呈現(xiàn)出高比

10、例的邊緣原子。在SNGC表面，GOD的循環(huán)伏安曲線(xiàn)呈現(xiàn)一對(duì)完好的、準(zhǔn)可逆的氧化還原峰。
　　 (6)本文提出了一種改良碳納米管(CNT)電催化性能的簡(jiǎn)單便利方法，并將其用于生化酶的直接電化學(xué)。在含0.05 M TBAB的DMF中，將CNT修飾電極從0--2.8 V電化學(xué)循環(huán)伏安掃描10個(gè)片段，得到陰極修飾碳納米管(CM-CNTs)。透射電子顯微鏡(TEM)下觀察到刻蝕后的CNT呈現(xiàn)較多的缺陷，因此裸露出更多的碳邊緣原子，有效地改