1、膽固醇氧化酶是一種重要的檢測(cè)用酶,除廣泛應(yīng)用于醫(yī)療檢測(cè)外,在食品開(kāi)發(fā)、醫(yī)療保健、生物農(nóng)藥等方面也有應(yīng)用潛力。鑒于微生物來(lái)源的膽固醇氧化酶表達(dá)量小且需要膽固醇誘導(dǎo)的問(wèn)題,本實(shí)驗(yàn)室成功構(gòu)建了一株可胞內(nèi)表達(dá)膽固醇氧化酶的基因工程菌,但是膽固醇氧化酶主要以包涵體的形式存在,活性膽固醇氧化酶表達(dá)量低。本文采取調(diào)整誘導(dǎo)劑,優(yōu)化發(fā)酵工藝等手段提高活性膽固醇氧化酶產(chǎn)率,建立一系列膽固醇氧化酶高效表達(dá)技術(shù),有助于實(shí)現(xiàn)膽固醇氧化酶高效低成本制備。
　

2、　 本文以一株胞內(nèi)表達(dá)膽固醇氧化酶的工程菌E coli BL21(DE3)-PET28a-COD為生產(chǎn)菌株,以減少包涵體形成,提高活性膽固醇氧化酶產(chǎn)率為目標(biāo),采用外因優(yōu)化與內(nèi)因優(yōu)化相結(jié)合的策略對(duì)膽固醇氧化酶發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化。
　　 1.采用乳糖誘導(dǎo)膽固醇氧化酶表達(dá),提高了膽固醇氧化酶可溶表達(dá)的比例,并優(yōu)化了乳糖誘導(dǎo)膽固醇氧化酶表達(dá)的條件。采用乳糖誘導(dǎo)膽固醇氧化酶表達(dá),酶活分別為0.76U/mL,0.45U/mg,是IPTG誘導(dǎo)

3、時(shí)的4.0和2.4倍,顯著提高了活性膽固醇氧化酶的表達(dá)水平。在優(yōu)化后的誘導(dǎo)條件下誘導(dǎo)膽固醇氧化酶表達(dá),酶活達(dá)到5.8U/mL,為初始條件的7.6倍。
　　 2.調(diào)節(jié)誘導(dǎo)階段溫度和pH提高活性膽固醇氧化酶產(chǎn)率,建立雙程培養(yǎng)策略。研究了菌體生長(zhǎng)和誘導(dǎo)階段的最佳溫度和最適pH,結(jié)果表明,菌體生長(zhǎng)階段最佳條件:溫度37℃,pH7.5;誘導(dǎo)階段最適條件:溫度30℃,pH6.5。采用雙程培養(yǎng)策略培養(yǎng)工程菌,膽固醇氧化酶酶活最終達(dá)到16.9U

4、/mL,生產(chǎn)強(qiáng)度為1.30U/(mL·h),分別提高了191％,347％;重組酶表達(dá)量占菌體總蛋白的32％,但可溶部分占膽固醇氧化酶表達(dá)量的68％,顯著提高膽固醇氧化酶的可溶表達(dá)水平。
　　 3.7L發(fā)酵罐中研究了工程菌的培養(yǎng)策略,進(jìn)一步提高活性膽固醇氧化酶產(chǎn)率。比較了四種補(bǔ)糖策略,確定采用葡萄糖補(bǔ)料培養(yǎng)菌體至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期,恒速流加乳糖誘導(dǎo)液誘導(dǎo)重組酶表達(dá)的方法獲得最大酶活20.5U/mL,提高了21％。制定pH-stat流加甘