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![香菇中γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)的分離純化及其酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf_第1頁](https://static.zsdocx.com/FlexPaper/FileRoot/2019-3/14/18/25464615-304e-4a61-af3e-d365bcc5c830/25464615-304e-4a61-af3e-d365bcc5c8301.gif)
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文檔簡介
1、香菇是一種味美、香氣濃郁、營養(yǎng)價值豐富的食用菌,廣受消費(fèi)者歡迎。但近年來,因其內(nèi)源性甲醛問題引發(fā)“香菇甲醛事件”,受到廣泛爭議。因此研究香菇內(nèi)源性甲醛形成機(jī)理,進(jìn)而從分子生物學(xué)角度上調(diào)控甲醛代謝,具有非常重要的意義。本課題以香菇中參與甲醛生成的關(guān)鍵酶-γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶為研究對象,優(yōu)化了酶的提取、分離和純化條件,深入研究了該酶的基本酶學(xué)特性,并初步探索了酶的結(jié)構(gòu)。本研究將為進(jìn)一步闡明香菇內(nèi)源性甲醛的代謝調(diào)控研究提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如
2、下:
1、采用超聲波輔助提取法,GGT提取率達(dá)到了8.24 U/g。與普通機(jī)械攪拌提取法相比,超聲波輔助提取法提取GGT得率提高了30%,因此該方法較好的改進(jìn)GGT提取工藝。選取料液比、提取時間、提取功率三個因素為超聲輔助提取法的單因素試驗,得到最佳條件為:提取功率、提取時間、料液比分別為200 W、30 min、1:50。選取料液比、提取時間、提取功率三個因素進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗設(shè)計,獲得了超聲輔助提取GGT的最佳條件,提取功
3、率、提取時間、料液比分別為:204.84.W,28.19 min,1:52.29。在最佳提取條件下,提取液中GGT的提取率達(dá)到11.07 U/g,與理論值基本相符。
2、采用硫酸銨分級沉淀對GGT粗提,選擇30%硫酸銨濃度進(jìn)行一級沉淀,70%硫酸銨濃度進(jìn)行二級沉淀,去除部分雜蛋白,實(shí)現(xiàn)目標(biāo)酶捕獲。通過考察平衡緩沖液濃度、洗脫流速、洗脫方式確定了Phenyl-Sepharose疏水層析分離GGT酶的最優(yōu)條件為:ψ2.6cm×
4、20 cm填充柱,2mL/min流速,0.05 mol/L Tris—HCl(pH7.6)、1.0mol/L(NH4)2SO4平衡緩沖體系,0.05 mol/L Tris—HCI(pH7.6)單一濃度洗脫。粗提液經(jīng)過30%~70%硫酸銨鹽沉、Phenyl—Sepharose層析純化、sephadex G-25凝膠層析脫鹽后,最終獲得電泳純的GGT酶組分,其純化倍數(shù)為178.1,得率為23.7%。采用SDS—PAGE和凝膠滲透色譜檢測了純
5、化到的目標(biāo)酶的純度,均顯示為單一組分。
3、單一組分的GGT分子量為88 kDa,兩個亞基的大小分別為28 kDa和60 kDa;純化酶的氨基酸組成中,酸性氨基酸谷氨酸含量最高,亮氨酸和蘇氨酸的含量也較高,而半胱氨酸和蛋氨酸的含量很低。以γ-glutamyl-P—nitroanilide為底物,研究了GGT的酶學(xué)性質(zhì)。酶的最適反應(yīng)pH為7.6;最適反應(yīng)溫度為37℃,溫度低于40℃時,酶表現(xiàn)較好的穩(wěn)定性,超過60℃時,酶活性
6、顯著降低,表明該酶的耐熱性較差;氧化γ-glutamyl-P—nitroanilide的動力學(xué)參數(shù)Vmax和Km分別為2.601μ mol/ml和0.0287μmol/min;多種金屬陽離子對該酶都有不同的影響,其中Na+、K+和Ca2+對酶活力有激活作用,而Cu2+、Ag+、Zn2+和Fe3+有效抑制酶活性。采用IEF-PAGE研究表明GGT酶的等電點(diǎn)為6.4。采用紅外光譜(FT-IR)分析GGT二級結(jié)構(gòu),得出β折疊、無規(guī)則卷曲、α螺
7、旋、β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)相對百分濃度分別為40.94%、15.90%、18.26%和24.90%。采用圓二色譜方法(CD)分析二級結(jié)構(gòu),表明α螺旋、β折疊含量分別為18.2%和47.7%,兩種分析二級結(jié)構(gòu)方法得到的結(jié)果基本一致。
4、篩選基本營養(yǎng)物質(zhì)、氨基酸、無機(jī)含S化合物、信號調(diào)控因子以及抗氧化劑5大類共14種物質(zhì)測定其對GGT純酶活性影響。結(jié)果顯示:半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、精氨酸等多數(shù)氨基酸對GGT酶活性有
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