1、目的:平滑肌在體內分布廣泛，其具有多種獨特的功能和復雜的調節(jié)機制，對維持人體生理功能起重要的調節(jié)作用。肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chainkianse，MLCK)是調節(jié)平滑肌收縮的關鍵酶。一般情況下，當平滑肌細胞受到刺激后，細胞內的Ca2+濃度升高并達到閾值，Ca2+和鈣調蛋白(calmodulin，CaM)結合形成Ca2+/CaM復合物，該復合物可以激活MLCK，活化的MLCK可以使肌球蛋白20kDa調節(jié)輕鏈（myo

2、sin light chains，MLC20）的第19位絲氨酸磷酸化，進而激活肌球蛋白頭部的Mg2+-ATP酶的活性，ATP水解釋放能量，促使肌球蛋白與肌動蛋白之間發(fā)生相互作用，引起平滑肌的收縮，這是平滑肌收縮的激酶調節(jié)機制。MLCK作為一種多功能調節(jié)蛋白質，除具有激酶活性外，還具有與肌動蛋白和肌球蛋白結合的非激酶活性。研究表明，MLCK對細胞增殖、遷移以及細胞骨架的重組也有重要的作用。在生理條件下，平滑肌細胞在Ca2+濃度下降后仍維持

3、一定程度張力，表明MLCK的非激酶作用可能在平滑肌收縮與舒張的調節(jié)過程中產生一定影響。以往的體外功能研究顯示:當MLCK的第1002-1022位CaM結合位點突變后，MLCK失去了磷酸化MLC20的激酶活性;并且它可以在無Ca2+/CaM條件下降低磷酸化肌球蛋白的Mg2+-ATP酶活性，增加非磷酸化肌球蛋白的Mg2+-ATP酶活性;同時它也可以降低體外肌動蛋白肌絲運動的速度。為了更好地研究MLCK分子的非激酶活性對血管平滑肌細胞增殖和遷

4、移的影響，本實驗擬構建MLCK的CaM結合位點突變真核表達載體。利用牛胃重組全長野生型MLCK，對其第1002-1022位氨基酸（即CaM結合位點）進行定點突變。本實驗在牛胃平滑肌MLCK的1002-1022CaM結合位點Trp1006突變?yōu)锳la的基礎上進行突變，使MLCK的1002-1022CaM結合位點中Arg1018突變?yōu)锳la（即AGA突變?yōu)镚CG）、Leu1019突變?yōu)锳la（即CTG中的CT突變?yōu)镚C），從而構建了牛胃ML

5、CK的1002-1022CaM結合位點突變的真核表達載體（pcDNA3.1-Flag-MLCK-Δ3CaM）。為了研究MLCK的非激酶活性對血管平滑肌細胞增殖和遷移的影響，將構建的MLCK的1002-1022CaM結合位點突變真核表達載體(pcDNA3.1-Flag-MLCK-Δ3CaM)轉染至MLCK基因缺失的豚鼠腦基底動脈血管平滑肌細胞(Gba M-)，對比轉染前后細胞增殖和遷移的變化。本實驗在以往研究的基礎上，為探索MLCK的非激

6、酶活性對平滑肌細胞功能的影響，進一步闡明平滑肌收縮的機制提供實驗依據。
　　方法:(1)根據牛胃MLCK cDNA序列設計CaM結合位點突變引物，利用PCR技術進行定點突變，構建CaM結合位點突變的原核表達載體(pColdⅠ-MLCK-Δ3CaM)和真核表達載體（pcDNA3.1-Flag-MLCK-Δ3CaM）。(2)將pcDNA3.1-Flag-MLCK-Δ3CaM轉染至Gba M-細胞，用免疫熒光法檢測質粒瞬時轉染情況。(3

7、)用合適濃度的G418篩選pcDNA3.1-Flag-MLCK-Δ3CaM穩(wěn)定轉染至Gba M-的細胞株。(4)用MTT法檢測pcDNA3.1-Flag-MLCK-Δ3CaM轉染至Gba M-后細胞增殖情況。(5)用劃痕法檢測pcDNA3.1-Flag-MLCK-Δ3CaM轉染至Gba M-后細胞遷移情況。
　　結果:(1)針對CaM結合位點設計突變引物，以pColdⅠ-MLCK-Δ1CaM為模板進行PCR，用NcoⅠ單酶切pCo

8、ldⅠ-MLCK-Δ1CaM質粒和pColdⅠ-MLCK質粒，分別從pColdⅠ-MLCK-Δ1CaM獲得556bp突變的目的片段，從pColdⅠ-MLCK獲得7.4kb的載體片段，用連接酶將556bp突變目的片段和7.4kb載體片段連接，獲得CaM結合位點三點突變的原核表達載體pColdⅠ-MLCK-Δ3CaM，該質粒經測序結果正確。(2)用KpnⅠ和EcoRⅠ雙酶切pColdⅠ-MLCK-Δ3CaM質粒pcDNA3.1-Flag-M

9、LCK真核表達質粒，分別從pColdⅠ-MLCK-Δ3CaM獲得3.4kb目的片段，從pcDNA3.1-Flag-MLCK獲得5.5kb的載體片段，用連接酶將3.4kb目的片段和5.5kb的載體片段連接獲得CaM結合位點三點突變的真核表達載體pcDNA3.1-Flag-MLCK-Δ3CaM，該質粒經測序結果正確。(3)用免疫熒光法檢測瞬時轉染情況，將pcDNA3.1-Flag-MLCK-Δ3CaM轉染至Gba M-細胞，發(fā)現(xiàn)轉染48小時

10、后的Gba M-細胞充分表達MLCK蛋白，轉染效率約達80％。(4)利用G418篩選質粒pcDNA3.1-Flag-MLCK-Δ3CaM穩(wěn)定轉染至Gba M-的細胞株，確定了G418對血管平滑肌細胞MLCK基因缺失型Gba SM-4的藥物最低致死濃度為500 ug/ml。(5)用MTT法檢測細胞增殖情況，結果顯示:與Gba SM-4細胞(未敲除MLCK)組相比，Gba M-（MLCK敲除）組細胞增殖率明顯升高;而分別將pcDNA3.1-

11、Flag-MLCK和pcDNA3.1-Flag-MLCK-Δ3CaM轉染到Gba M-后細胞增殖率均明顯降低，但二者未見顯著差異(p＞0.05)。(6)用劃痕法檢測細胞遷移，結果顯示:與Gba SM-4組相比，Gba M-組細胞遷移率降低，而分別轉染pcDNA3.1-Flag-MLCK和轉染pcDNA3.1-Flag-MLCK-Δ3CaM到GbaM-后細胞遷移率均升高，但二者未見明顯差異(p＞0.05)。
　　結論:(1)成功的構