1、CTB-LK是將蚓激酶(LK)和霍亂毒素B型亞單位(CTB)通過(guò)基因融合，并在畢赤酵母中獲得表達(dá)的一種新型抗血栓腸吸收蛋白，經(jīng)過(guò)體外和小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均證明CTB-LK具有很好的預(yù)期酶活和高效腸吸收特性。
　　 為提高CTB-LK的表達(dá)量，本研究以實(shí)驗(yàn)室已有的CTB-LK基因?yàn)榛A(chǔ)，在不改變所編碼氨基酸的情況下，使用基因重疊延伸PCR(gene SOEing PCR)技術(shù)，對(duì)該基因中4個(gè)編碼氨基酸的密碼子位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，將4個(gè)畢赤

2、酵母稀有密碼子分別突變成畢赤酵母高頻密碼子。并構(gòu)建了優(yōu)化基因CTB-LKA的中間克隆載體pBluescript SK-CTB-LKA和畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9k-CTB-LKA，電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，篩選獲得了CTB-LKA畢赤酵母表達(dá)菌株。
　　 對(duì)CTB-LKA畢赤酵母發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行的SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)表明，在45kD處出現(xiàn)了預(yù)期條帶。在纖維平板溶栓實(shí)驗(yàn)中，發(fā)酵產(chǎn)物表現(xiàn)出纖維蛋白溶解酶的活性.表明CTB-LKA蛋白在

3、畢赤酵母內(nèi)得到了正確的表達(dá)和折疊。與同等體積CTB-LK畢赤酵母表達(dá)菌株發(fā)酵產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳條帶對(duì)比，前者在45kD處的條帶更明顯。通過(guò)使用纖維蛋白平板實(shí)驗(yàn)對(duì)CTB-LKA畢赤酵母表達(dá)菌株發(fā)酵產(chǎn)物溶纖活性測(cè)定結(jié)果表明，在BMGY/BMMY培養(yǎng)基中誘導(dǎo)36h后，酶活力達(dá)2450mm2/mL，比CTB-LK畢赤酵母表達(dá)菌株發(fā)酵產(chǎn)物酶活性提高了1.9倍。以上結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化的CTB-LKA基因與未經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化的CTB-LK