1、富馬酸(Fumaric acid)作為一種重要的有機(jī)基本化工原料和大宗化工產(chǎn)品，廣泛應(yīng)用于涂料、樹脂、醫(yī)藥、增塑劑、食品添加劑等領(lǐng)域，具有重要的市場價(jià)值。目前工業(yè)上制備富馬酸主要以順酐異構(gòu)法為主。與其相比，生物法具有原料可持續(xù)供應(yīng)、操作條件溫和、環(huán)境污染小等優(yōu)勢。隨著生物技術(shù)的不斷進(jìn)步和化石資源的日益耗盡，生物法合成富馬酸成為化工行業(yè)可持續(xù)發(fā)展的必然選擇。米根霉(Rhizopus oryzae)是常用的富馬酸生產(chǎn)菌，本文在誘變得到一株高

2、產(chǎn)富馬酸的米根霉的基礎(chǔ)上，對其種子培養(yǎng)和發(fā)酵產(chǎn)酸的方法進(jìn)行了探索和優(yōu)化，建立了一套系統(tǒng)有效的發(fā)酵路線，為以后富馬酸的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了扎實(shí)的基礎(chǔ)。論文主要工作如下：
　　 1.米根霉富馬酸高產(chǎn)菌株的誘變育種
　　 根據(jù)代謝調(diào)控育種原理，設(shè)計(jì)了溴甲酚綠與丙烯醇平板的雙初篩標(biāo)準(zhǔn)，建立了一種富馬酸高產(chǎn)菌株的誘變篩選方法。首先，根據(jù)致死率、突變率以及篩選結(jié)果，確定了紫外、化學(xué)誘變的最佳誘變條件分別為：紫外誘變時(shí)間1min，誘變孢子

3、液稀釋1000倍；化學(xué)誘變劑亞硝酸濃度0.1mol/L，誘變時(shí)間10min，誘變孢子液稀釋100倍。在優(yōu)化條件下，通過紫外和化學(xué)的復(fù)合誘變獲得了一株產(chǎn)量高且穩(wěn)定性好的米根霉突變株ME-F12，產(chǎn)量達(dá)到50.39g/L，與原始菌株相比提高23％，連續(xù)傳代5次后，產(chǎn)量無明顯降低，具有較高穩(wěn)定性，其副產(chǎn)物乙醇濃度只有1.87g/L，明顯低于原始菌株。
　　 2.米根霉在5L發(fā)酵罐的種子培養(yǎng)和形態(tài)控制
　　 在5L發(fā)酵罐水平上對

4、該突變株的種子培養(yǎng)和形態(tài)控制進(jìn)行了研究，確定了形成菌球的較佳條件為：控制米根霉在發(fā)酵罐內(nèi)的孢子濃度在5×104-8.3×104/ml的范圍內(nèi)，攪拌轉(zhuǎn)速350r/min，pH為2.80，以20g/L的葡萄糖濃度作為最佳種齡的經(jīng)驗(yàn)值，判斷最佳種齡為52h。為進(jìn)一步減少種子培養(yǎng)時(shí)間，采用雙階段調(diào)控策略控制pH，前8h控制pH為3.50，然后降低至2.80，該條件下最佳種齡縮短至44h，此時(shí)可以獲得表面光滑結(jié)實(shí)的球狀菌體(直徑在1mm左右)。利

5、用該菌球進(jìn)行發(fā)酵，富馬酸產(chǎn)量達(dá)到47.3g/L，轉(zhuǎn)化率59.1％。
　　 3.米根霉發(fā)酵制備富馬酸的條件優(yōu)化
　　 對發(fā)酵產(chǎn)酸過程的條件和培養(yǎng)基組成進(jìn)行了優(yōu)化，首先確定基礎(chǔ)的發(fā)酵條件為接種量15％，轉(zhuǎn)速220r/min，裝液量40ml，發(fā)酵溫度32℃；然后以富馬酸產(chǎn)量和生產(chǎn)速率為目標(biāo)，利用基于Desirability函數(shù)的響應(yīng)曲面法確定了葡萄糖和尿素的最佳濃度為葡萄糖135g/L、尿素0.06g/L；針對培養(yǎng)基中的金屬離

6、子，采用Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)曲面的方法篩選并優(yōu)化了重要的金屬離子濃度為：KH2PO41.8g/L、MgSO47·H2O1.0g/L、ZnSO4·7H2O0.157g/L、FeSO4·7H2O0.0076g/L、CoCl2·6H2O0.005g/L；最后，根據(jù)負(fù)反饋調(diào)節(jié)原理，考察了添加蘋果酸、乳酸對發(fā)酵過程的影響，確定外源添加0.5g/L乳酸和0.5g/L蘋果酸，提高富馬酸產(chǎn)量的同時(shí)能夠抑制副產(chǎn)物的生成。最終富馬酸產(chǎn)