1、研究背景：
　　動(dòng)脈粥樣硬化是誘發(fā)心腦血管疾病的重要病理基礎(chǔ)，巨噬泡沫細(xì)胞的形成是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病早期典型的病理改變。最新研究證實(shí)，巨噬細(xì)胞的自噬溶酶體活性與膽固醇代謝狀況以及泡沫細(xì)胞的形成密切相關(guān)。因此，調(diào)控巨噬細(xì)胞的自噬過(guò)程，減少巨噬泡沫細(xì)胞的形成，成為治療動(dòng)脈粥樣硬化及相關(guān)疾病的核心。近年來(lái)，SUMO(small ubiquitin-related modifier)化修飾作為一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾過(guò)程，參與胚胎發(fā)生發(fā)育

2、、腫瘤轉(zhuǎn)移等多種生理病理過(guò)程，已成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。我們前期研究證實(shí)調(diào)控自噬溶酶體生成最重要的轉(zhuǎn)錄因子TFEB(transcription factor EB)能夠發(fā)生SUMO化修飾，因此，我們推測(cè)TFEB的SUMO化修飾通過(guò)調(diào)控自噬溶酶體生成參與了巨噬泡沫細(xì)胞的形成。
　　目的：
　　本研究通過(guò)觀察TFEB的SUMO化修飾對(duì)巨噬細(xì)胞自噬體溶酶體生成的影響，深入探討其在動(dòng)脈粥樣硬化巨噬泡沫細(xì)胞形成過(guò)程中的作用及機(jī)制。這些研

3、究將有助于進(jìn)一步了解蛋白質(zhì)SUMO化修飾及其調(diào)控的生物學(xué)功能，并進(jìn)一步了解巨噬泡沫細(xì)胞形成的機(jī)理及在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生中的作用。
　　方法：
　　一、培養(yǎng)THP-1巨噬細(xì)胞，給予氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)處理24h，應(yīng)用免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞TFEB的SUMO化修飾水平的變化。
　　二、運(yùn)用慢病毒技術(shù)構(gòu)建過(guò)表達(dá)人TFEB(TFEB)和SUMO化位點(diǎn)突變的TFEBTHP-1(TFEB K316R)巨噬細(xì)胞株，以空

4、載病毒細(xì)胞作為陰性對(duì)照組，應(yīng)用電鏡技術(shù)觀察各組巨噬細(xì)胞自噬生成情況;應(yīng)用免疫熒光技術(shù)及western blot檢測(cè)各組巨噬細(xì)胞自噬生成標(biāo)志LC3的表達(dá)情況。
　　三、培養(yǎng)過(guò)表達(dá)TFEB和SUMO化位點(diǎn)突變的TFEB巨噬細(xì)胞，以空載病毒細(xì)胞作為陰性對(duì)照組，應(yīng)用電鏡技術(shù)及Lysotracker染色觀察各組巨噬細(xì)胞溶酶體生成情況;應(yīng)用免疫熒光技術(shù)及western blot檢測(cè)各組巨噬細(xì)胞中溶酶體生成標(biāo)志LAMP1的表達(dá)情況。
　　

5、四、培養(yǎng)過(guò)表達(dá)TFEB和SUMO化位點(diǎn)突變的TFEB巨噬細(xì)胞，以空載病毒細(xì)胞作為陰性對(duì)照組，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測(cè)各組巨噬細(xì)胞TFEB下游靶基因（自噬及溶酶體生成相關(guān)基因）的表達(dá)情況。
　　五、培養(yǎng)過(guò)表達(dá)TFEB和SUMO化位點(diǎn)突變的TFEB巨噬細(xì)胞，以空載病毒細(xì)胞作為陰性對(duì)照組，給予ox-LDL處理24h，通過(guò)熒光分光光度計(jì)檢測(cè)各組巨噬細(xì)胞總膽固醇(TC)、膽固醇酯(CE)含量及膽固醇酯水解率;用液體閃爍計(jì)數(shù)法檢測(cè)各組

6、巨噬細(xì)胞膽固醇流出率;
　　六、培養(yǎng)過(guò)表達(dá)TFEB和SUMO化位點(diǎn)突變的TFEB巨噬細(xì)胞，以空載病毒細(xì)胞作為陰性對(duì)照組，給予ox-LDL處理24h，應(yīng)用油紅O及Nile red染色觀察各組巨噬細(xì)胞泡沫細(xì)胞形成情況。
　　結(jié)果：
　　一、在巨噬泡沫細(xì)胞形成過(guò)程中，TFEB的SUMO化修飾水平的改變
　　培養(yǎng)人THP-1巨噬細(xì)胞，我們檢測(cè)到了內(nèi)源性TFEB的SUMO化修飾條帶。并且，給予50μg/mL ox-LDL刺

7、激24h后，發(fā)現(xiàn)TFEB的SUMO化修飾水平較對(duì)照組明顯降低，說(shuō)明在ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞泡沫化過(guò)程中，TFEB的SUMO化修飾水平受到顯著抑制。
　　二、TFEB的SUMO化修飾對(duì)巨噬細(xì)胞自噬的影響
　　電鏡結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，TFEB組巨噬細(xì)胞內(nèi)自噬體的數(shù)量明顯增加，而TFEB K316R組巨噬細(xì)胞內(nèi)自噬體的數(shù)量明顯較TFEB組顯著減少(均P＜0.05)。并且，TFEB組巨噬細(xì)胞內(nèi)自噬生成標(biāo)志LC3的蛋白表達(dá)量較T

8、FEB K316R組顯著明顯增加。這些結(jié)果說(shuō)明TFEB的SUMO化修飾促進(jìn)巨噬細(xì)胞自噬。
　　三、TFEB的SUMO化修飾對(duì)巨噬細(xì)胞溶酶體生成的影響
　　電鏡和Lysotracker染色結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，TFEB組巨噬細(xì)胞溶酶體數(shù)量增多（P＜0.05），體積增大;而TFEB K316R組巨噬細(xì)胞內(nèi)溶酶體數(shù)量和體積較對(duì)照組無(wú)明顯差異。并且，TFEB組巨噬細(xì)胞溶酶體生成標(biāo)志LAMP1的蛋白表達(dá)量較TFEBK316R組明顯增

9、加。這些結(jié)果說(shuō)明TFEB的SUMO化修飾促進(jìn)巨噬細(xì)胞溶酶體的生成。
　　四、TFEB的SUMO化修飾對(duì)TFEB下游自噬及溶酶體生成基因表達(dá)的影響
　　與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)TFEB明顯增加巨噬細(xì)胞自噬(LC3，ULK1，WIP1，ATG9B，Becline1)和溶酶體(LAMP1，CTSB，CLCN7，ATP6V1A)生成相關(guān)基因的表達(dá)，但是TFEB K316R組內(nèi)自噬溶酶體生成相關(guān)基因的表達(dá)量較TFEB組明顯降低(均P＜0.

10、05)。這些結(jié)果說(shuō)明TFEB的SUMO化修飾促進(jìn)巨噬細(xì)胞自噬及溶酶體生成相關(guān)基因的表達(dá)。
　　五、TFEB的SUMO化修飾對(duì)巨噬泡沫細(xì)胞膽固醇流出的影響
　　與對(duì)照組相比，TFEB組巨噬細(xì)胞內(nèi)TC和CE含量明顯降低，膽固醇酯水解程度顯著增加，apoA-Ⅰ介導(dǎo)的膽固醇流出增多（均P＜0.05）;而TFEB K316R組巨噬細(xì)胞內(nèi)TC和CE含量較TFEB組明顯增加，膽固醇酯水解程度顯著降低，apoA-Ⅰ介導(dǎo)的膽固醇流出減少(均P

11、＜0.05)。這些結(jié)果說(shuō)明TFEB的SUMO化修飾促進(jìn)巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯的水解，增加膽固醇的流出。
　　六、TFEB的SUMO化修飾對(duì)巨噬泡沫細(xì)胞形成的影響
　　油紅O及Nile red染色結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，TFEB組巨噬細(xì)胞內(nèi)脂滴聚集及泡沫細(xì)胞形成明顯減少;而TFEB K316R組巨噬細(xì)胞內(nèi)脂滴聚集及泡沫細(xì)胞形成較TFEB組顯著增多，這些結(jié)果說(shuō)明，TFEB的SUMO化修飾抑制了巨噬泡沫細(xì)胞的形成。
　　結(jié)論：<