1、多西他賽(docetaxel，DTX)是由歐洲紅豆杉屬植物漿果紫杉(Europeanyewtree，Taxusbaccata)的針葉中提取或半合成的第二代紫杉烷類抗腫瘤化合物，其通過(guò)阻斷微管系統(tǒng)進(jìn)而阻斷有絲分裂期及有絲分裂間期的細(xì)胞功能而發(fā)揮抗腫瘤作用。多西他賽作為一種高效的細(xì)胞毒類藥物已廣泛用于實(shí)體瘤如早期或轉(zhuǎn)移性乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、胃癌等的治療。然而多西他賽也存在較多毒副作用，如會(huì)導(dǎo)致中性粒細(xì)胞減少、骨骼肌毒性外周神經(jīng)病變及超敏反

2、應(yīng)等，這些都影響了其在臨床上的應(yīng)用。原因主要有以下幾個(gè)方面，一是多西他賽在體內(nèi)通過(guò)非特異性方式分布，無(wú)腫瘤靶向性;二是多西他賽為多環(huán)結(jié)構(gòu)，在水中難溶，目前臨床上應(yīng)用的上市劑型是含高濃度的非離子型表面活性劑吐溫-80和乙醇(50∶50，V/V)的注射劑，但此溶劑體系會(huì)引起超敏反應(yīng)，并且能誘導(dǎo)輸液時(shí)使用的聚氧乙烯(PVA)袋產(chǎn)生泄露;三是已有報(bào)道顯示乳腺癌患者對(duì)多西他賽存在固有性或獲得性多藥耐藥性，嚴(yán)重降低了藥物的療效。因此，需要選用合適的

3、載藥系統(tǒng)以提高多西他賽的溶解度，增加靶向性，降低藥物的毒副作用并逆轉(zhuǎn)其多藥耐藥性。
　　 共聚物膠束作為一種新型的藥物載體，是一類由親水鏈與疏水鏈在水溶液中自發(fā)排列形成的二嵌段(AB)或三嵌段(BAB)核殼型結(jié)構(gòu)的兩親性聚合物。其疏水片段形成膠束內(nèi)核，親水片段形成膠束外殼，內(nèi)核可以作為疏水性藥物的儲(chǔ)庫(kù)增溶藥物。由于共聚物膠束在納米載藥體系中的突出優(yōu)勢(shì)，近些年來(lái)已引起人們的廣泛研究，尤其是混合膠束，它可集合多種不同類型單一聚合物膠

4、束的優(yōu)點(diǎn)，穩(wěn)定性顯著增加。因此，本課題選用了兩種無(wú)毒、生物可降解并具有逆轉(zhuǎn)藥物多藥耐藥性的共聚物材料，制備了兩種混合膠束，增加了多西他賽的溶解度、腫瘤靶向性及進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的藥量。一是載多西他賽的混合膠束;二是細(xì)胞穿膜肽TAT介導(dǎo)的載多西他賽的混合膠束，其中TAT可攜帶載體有效地進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，從而使得膠束在具有靶向腫瘤部位特定的同時(shí)，增加了藥物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮藥效的量，以進(jìn)一步提高治療效果。論文將對(duì)兩種混合膠束制劑進(jìn)行系統(tǒng)的理化性質(zhì)、體外細(xì)胞毒

5、性以及體內(nèi)藥物代謝動(dòng)力學(xué)行為和體內(nèi)組織分布研究，并對(duì)其在腫瘤治療中的應(yīng)用前景進(jìn)行探討。課題的主要實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果如下:
　　 1.載多西他賽的MPP/P123混合膠束制劑的研究
　　 本實(shí)驗(yàn)選用薄膜分散法制備載多西他賽的混合膠束，在單因素考察的基礎(chǔ)上，以星點(diǎn)-效應(yīng)面法設(shè)計(jì)并優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，篩選最優(yōu)的處方及制備工藝。為增加保存過(guò)程中的穩(wěn)定性，以甘露醇為凍干保護(hù)劑，采用冷凍干燥法制備凍于制劑。同時(shí)還對(duì)膠束制劑凍干前后的理化性質(zhì)進(jìn)

6、行了考察，包括膠束的外觀形態(tài)、粒徑及其分布、zeta電勢(shì)、包封率及載藥量。
　　 芘探針?lè)y(cè)得混合膠束的CMC為0.0100mg/mL，小于P123的CMC(0.0162mg/mL)。凍干前后，透射電子顯微鏡觀察膠束的均呈球形或類球形，且表面光滑無(wú)粘連;動(dòng)態(tài)光散射法測(cè)得粒徑分別為22.7nm和27.3nm，多分散系數(shù)都較小;zeta電勢(shì)為-5.46mV和-4.65mV，呈現(xiàn)弱的電負(fù)性;混合膠束的包封率高達(dá)97.25％，載藥量為2

7、.3％。
　　 2.TAT介導(dǎo)的載多西他賽混合膠束的研究
　　 首先利用mal-PEG-OH與D，L-丙交酯進(jìn)行丙交酯開(kāi)環(huán)聚合反應(yīng)，合成mal-PEG-PLA聚合物，然后與TAT反應(yīng)制備TAT-PEG-PLA。將生成的產(chǎn)物和MPP、P123以適當(dāng)?shù)谋壤苽銽AT介導(dǎo)的載有多西他賽的混合膠束（TAT-MM/DTX）。使用透射電子顯微鏡觀察膠束呈球形或類球形;測(cè)得平均粒徑為30.17nm，粒徑分布較窄;Zeta電勢(shì)為5.84

8、±0.55mV。體外釋放實(shí)驗(yàn)中，本實(shí)驗(yàn)分別模擬正常血液及腫瘤部位的pH值，選用pH7.4和pH5.0的緩沖液為釋放介質(zhì)，研究制劑的釋放速率。結(jié)果顯示MM/DTX及TAT-MM/DTX兩種混合膠束制劑的體外釋放曲線相似，并且與多帕菲(R)相比，混合膠束制劑有明顯的緩釋作用。在pH5.0條件下兩種膠束制劑的釋放速率快于pH7.4時(shí)的釋放速率，由此可知，藥物從膠束制劑中釋放顯示了一定的pH依賴性。
　　 3.混合膠束體外抗腫瘤評(píng)價(jià)

9、r>　　 本實(shí)驗(yàn)采用MTT法研究了多帕菲(R)、MM、TAT-MM膠束對(duì)人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)、多藥耐藥的人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7/MDR)及人肝癌細(xì)胞(HepG2)的細(xì)胞毒性作用。與多帕菲(R)相比，兩種膠束制劑的抗腫瘤能力明顯增強(qiáng)，抗腫瘤活性為TAT-MM/DTX膠束＞MM/DTX膠束＞多帕菲(R);多西他賽原料藥、多帕菲(R)、MM/DTX及TAT-MM/DTX的半數(shù)抑制濃度分別為，MCF-7:5.56±0.51、1.94±

10、0.17、0.7973±0.08、0.444±0.03μg/mL;HepG-2:10.29±0.62、4.82±0.39、1.91±0.15、0.61±0.05μg/mL;MCF-7/MDR:58.13±3.92、36.37±2.67、5.50±0.42、1.98±0.11μg/mL。流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，三種細(xì)胞對(duì)TAT-MM膠束的攝取量明顯高于MM。
　　 4.混合膠束給藥系統(tǒng)的體內(nèi)研究
　　 兔子靜脈注射多帕菲(R

11、)及MM/DTX、TAT-MM/DTX膠束三種制劑后，以DAS2.0軟件分析各個(gè)時(shí)間點(diǎn)血藥濃度結(jié)果顯示，三種制劑在兔子體內(nèi)均符合二室模型，藥動(dòng)學(xué)方程分別為c=86628e-44.6t+5843e-1.57t，c=12349e-10.95t+4150e-0.558t，c=6542e-7.91t+4150e-0.478t，與多帕菲(R)的ACU(8064ng/L/h)相比，MM/DTX、TAT-MM/DTX兩種膠束制劑的ACU(16604n

12、g/L/h、13815ng/L/h)明顯增大;同時(shí)兩種膠束制劑的MRT(9.754h、6.81h)均大于多帕菲(R)的MRT(2.454h)。因此，由實(shí)驗(yàn)可知，與多帕菲(R)相比，靜脈注射給藥后，MM/DTX、TAT-MM/DTX兩種膠束制劑均能延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)的滯留時(shí)間，具有緩釋的作用。
　　 動(dòng)物體內(nèi)的組織分布通過(guò)裸鼠體內(nèi)活體成像實(shí)驗(yàn)測(cè)定，結(jié)果表明，通過(guò)裸鼠尾靜脈注射給予MM/DiR、TAT-MM/DiR膠束后，制劑均可快速分

13、布到腫瘤部位，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，肝臟處的熒光強(qiáng)度逐漸減弱，腫瘤部位的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，說(shuō)明藥物蓄積在肝臟形成的藥物儲(chǔ)庫(kù)，緩慢釋放出來(lái)，并濃集于腫瘤部位。因此，MM/DTX、TAT-MM/DTX兩種膠束制劑有明顯的腫瘤靶向性，可極大地降低藥物對(duì)正常組織器官的毒性，在腫瘤疾病的治療中有重要臨床意義。
　　 綜上所述，本課題制備的多西他賽混合膠束制備工藝簡(jiǎn)單，重現(xiàn)性及穩(wěn)定性良好，大大提高了多西他賽的溶解度，并可被動(dòng)靶向于腫瘤組織，同時(shí)